Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene di interesse coinvolto nella coniugazione dei plasmidi e successivamente analizzare l'impatto della sua assenza utilizzando saggi di accoppiamento. La funzione del gene viene ulteriormente esplorata in una regione specifica della sua sequenza utilizzando mutazioni di delezione o puntiformi.
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Articolo metodologico
Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trasferimento di materiale genetico per coniugazione batterica è un processo che avviene tramite complessi formati da specifiche proteine di trasferimento. In Escherichia coli, queste proteine di trasferimento costituiscono un meccanismo di trasferimento del DNA noto come formazione della coppia di accoppiamento, o complesso di trasferimento del DNA, che facilita il trasferimento coniugativo del plasmide. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un metodo che possa essere utilizzato per determinare il ruolo di una specifica proteina di trasferimento coinvolta nella coniugazione utilizzando una serie di delezioni e/o mutazioni puntiformi in combinazione con saggi di accoppiamento. Il gene bersaglio viene eliminato sul plasmide coniugativo e viene quindi fornito in trans attraverso l'uso di un piccolo plasmide di recupero che ospita il gene bersaglio. Le mutazioni che interessano il gene bersaglio sul plasmide di recupero possono rivelare informazioni sugli aspetti funzionali della proteina bersaglio che provocano l'alterazione dell'efficienza di accoppiamento delle cellule donatrici che ospitano il gene mutato. Le alterazioni nell'efficienza dell'accoppiamento forniscono informazioni sul ruolo e l'importanza della particolare proteina di trasferimento, o di una regione in essa, nel facilitare il trasferimento coniugativo del DNA. L'abbinamento di questo saggio di accoppiamento con studi strutturali tridimensionali dettagliati fornirà una comprensione completa della funzione della proteina di trasferimento coniugativa, oltre a fornire un mezzo per identificare e caratterizzare le regioni di interazione proteina-proteina.
Introduzione
Il trasferimento di geni e proteine a livello micro-organismal svolge un ruolo centrale nella sopravvivenza dei batteri e l'evoluzione, nonché i processi di infezione. Lo scambio di DNA tra batteri o tra un batterio e una cellula può essere ottenuto attraverso la trasformazione, coniugazione o trasduzione vettoriale. 1,2 coniugazione è unico rispetto alla trasformazione e trasduzione dal fatto che durante la coniugazione tra batteri gram-negativi come Escherichia coli, il trasferimento del DNA avviene in modo donatore controllato quale un sistema macromolecolare complesso collega cellule donatrici e riceventi. Coniugazione è anche il modo pi....
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Protocollo
1. Generazione di costrutti di DNA
- Progettare oligomeri per ricombinazione omologa del gene bersaglio
- Progettare un singolo 55-72 bp oligomero avanti come segue: (a) scegliere un 19-32 bp lunga sequenza nucleotidica che è omologa ad una sequenza di DNA della regione 10-100 bp a monte del sito di inizio della 5 'del gene acetiltransferasi cloramfenicolo nel plasmide pBAD33 commerciale, 32 e (b) selezionare un 36-54 bp lunga sequenza nucleotidica omologa ad una regione 10-150 bp a valle del sito di inizio della 5 'del gene bersaglio di interesse.
- Partecipa 'fine sequenza nucleotidi....
- Progettare un singolo 55-72 bp oligomero avanti come segue: (a) scegliere un 19-32 bp lunga sequenza nucleotidica che è omologa ad una sequenza di DNA della regione 10-100 bp a monte del sito di inizio della 5 'del gene acetiltransferasi cloramfenicolo nel plasmide pBAD33 commerciale, 32 e (b) selezionare un 36-54 bp lunga sequenza nucleotidica omologa ad una regione 10-150 bp a valle del sito di inizio della 5 'del gene bersaglio di interesse.
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Risultati
Il processo di F coniugazione batterica plasmide-driven è un processo coordinato che coinvolge le proteine di trasferimento all'interno della regione Tra della F-plasmide che assembla un T4SS per facilitare la sintesi pilus e il trasferimento di DNA coniugativo. La proteina traffico (GenBank adesione # BAA97961; UniProt ID P14497) è necessario per conjugative formazione F-pilus. 10,14,35 - 37 La proteina contiene un dominio tioredossina come C-te.......
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Discussione
processo Coniugazione batterica fornisce un mezzo attraverso il quale i batteri possono diffondersi geni mediante un vantaggio evolutivo di crescita in ambienti difficili, come la diffusione di marcatori di resistenza agli antibiotici. Poiché molti dei plasmidi coniugativi sono così grandi, 12 studi funzionali sulle proteine coinvolte nel montaggio del dispositivo di trasferimento attraverso la mutazione di geni bersaglio sul plasmide coniugativo si sono ingombranti. I protocolli descritti qui forniscono un m.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del Discovery Sciences & Engineering Consiglio Naturale del Canada (NSERC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di mini-preparazione del plasmide GeneJet | Fisher Scientific | K0503 | |
| Kit di estrazione del gel GeneJet | Fisher | Scientific K0692 | |
| Kit di purificazione PCR GeneJet | Scientific K0702 | ||
| Q5 Kit di mutagenesi sito-diretta | New England Biolabs | E0554S | |
| Scala DNA ad ampio raggio | New England Biolabs | N0303A | |
| Piastre di Petri | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Elettroporatore | Eppendorf | 4309000027 | |
| Cuvette per elettroporazione | Fisher Scientific | FB101 | Le cuvette hanno una distanza di 1 mm. |
| Enzimi | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polimerasi | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligasi | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotici | Concentrazioni finali | ||
| Cloramfenicolo (cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 &; g/mL |
| di Kanamicina (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µ g/mL |
| Acido nalidixico (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µ g/mL |
| di Rifampicina (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µ g/mL |
| di Tetraciclina (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µ g/mL |
| di streptomicina (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 &; g/mL |
Riferimenti
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4
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Ristampe e permessi
