单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性
Summary
这个协议描述如何评估在克隆水平大阵列的基因的表达。单细胞RT-qPCR的产生与数百个样品和基因的敏感性较强高度可靠的结果。
Abstract
基因表达的异质性是一个有趣的功能在淋巴人群进行调查。在这些细胞中的基因表达细胞活化，应力，或刺激过程中变化。单细胞多路复用基因表达使几十基因1，2，3的的同时评估。在单细胞水平，多重基因表达的确定群体异质4,5。它允许人口异质性通过确定双方的成熟细胞中不同的前体阶段的可能搭配，也是细胞对刺激的多样性的区别。
先天淋巴样细胞（ILC）最近已描述为免疫应答6,7的固有效应的群体。在这个协议中，国际劳工大会，他的细胞的异质性稳态期间patic隔室进行了研究。
目前，最广泛使用的技术来评估基因表达，RT-qPCR的。这种方法的措施的基因表达在一个时间只有一个基因。此外，这种方法不能估计的基因表达的异质性，因为需要一个测试多个小区。这导致了人口的平均基因表达的测量。当评估大量基因，RT-qPCR的变成了时间，试剂 – 和样品消耗的方法。因此，折衷限制了可以被评估的基因或细胞群体的数量，增加丢失全局图像的风险。
该原稿描述单细胞多重RT-qPCR的如何可以被用来克服这些限制。这项技术已经从最近的微流控技术的进步1,2受益。在多重RT-qPCR的芯片发生的反应不EXCEED纳升一级。因此，单细胞基因表达，以及同时多个基因的表达，可以以试剂 – 进行的，样品 – 和成本效益的方式。有可能在不同的发育阶段，或在不同条件4下，5群内的细胞亚群之间的克隆水平检验细胞基因标记的异质性。在罕见的人群拥有大量的在单细胞水平的条件下工作不再是一种限制。
Introduction
在过去的几年中，先天淋巴样细胞（劳工公约）已经被越来越多的研究。尽管他们缺乏抗原特异性受体，它们都属于淋巴谱系和代表组织稳态和炎症的重要哨兵。目前国际劳工公约分为基于他们的特异性转录因子组合，表达对他们产生细胞因子6,7能力三组。
国际劳工公约向众多稳态和病理情况在通过特定的细胞因子产生8,9多样器官。为了能够理解这些细胞的作用，重要的是要确定每个器官的各种ILC亚群，并确定其发展的关系。此外，不同的子集之间的可塑性现象已涉及。通过研究异质性存在于一个器官的细胞，有可能来分隔它们的成熟的阶段，并区分其特定的功能。
为了说明单细胞多重RT-qPCR的的技术，肝国际劳工公约被选择，特别强调他们的异质同ILC组（1型ILC）10中。首先，通过使用流式细胞仪的，三种不同的ILC种群特征肝脏。组1 ILC代表约80％的固有效应，而其他两个群体是罕见的肝ILC种群（先天效应小于5％）。这些人群采用ILC人群的广泛表达的细胞表面标记来分类的。其结果，排序在肝脏ILC种群看大致类似一个到另一个。
单细胞多重RT-qPCR的已经成为最好的技术之一迅速调查这些人群11的异质性</s了>。两个主要特点是通过取单细胞多重RT-qPCR的技术的优点来确定。首先，通过观察克隆的水平，就有可能恢复细胞特异性基因表达，显然显示类似的发育阶段的细胞之间的比较。然后，通过观察基因表达的一个预先选择的组合中，我们将根据在一个时间点同时基因表达模式确定新的基因标记。这些方面允许的各种各样的表达数据收集的大量的细胞，甚至在稀有人群中，由于该技术是在克隆水平执行。从而，在肝脏ILC异质可以充分评估。
接着，通过排序具有全球ILC表型的所有细胞中，获得了肝ILC种群的多基因表达的广泛概述，即使它们代表极为罕见的人群。基于微流控芯片允许实验与连少量的细胞材料。作为结果，可以得到稀有细胞群的基因表达图谱。采用在线基因签名分析软件，细胞群簇和潜在细胞关系可以进行调查。因此，功能性测试可以被执行以验证在体内水平聚类数据。
基因表达的几十可能伴随在同一芯片3，11，12在数百或更多的单细胞进行评估。该测定的设计是在实验的最长的和最重要的部分。相关的假设要测试的基因的确定是非常重要的，以获得相关的结果。其次，需要内部控制（例如用于排序已知的表面标记）和具体的控制。这是至关重要的，以测试引物扩增特异性，扩增的效率，和叔他没有底漆的竞争。因此，与单细胞多重RT-qPCR的工作是一个省时的技术中，作为一个单元的多基因表达的同时进行评估。
使用试剂的相同的芯片和混合所有单元限制操作的可能的错误，并允许样品之间的再现性。总之，单细胞多重RT-qPCR的不同方面允许在克隆水平生产高度可靠的结果，具有灵敏度的为各种各样的样品和基因的大的水平。所得结果提供生物统计学测试功能强大且可靠的数据。
这可以是由于该方法，其允许在非常少量的物质的工作，并导致详尽结果的微流体方面来实现。最后，使用在线软件，它可以比较所需的人口。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了如何获取在克隆层面详尽的基因表达信息。在这里，我们调查了肝ILC车厢异质性。不同ILC种群（基于广泛表达ILC表面标记）的单细胞分选后，将样品预扩增特定预先选择的基因。然后，将得到的cDNA和引物装载到多重RT-qPCR的微流体芯片。最后，我们从48个单细胞获得的48个不同基因的表达。基因表达结果通过在线软件研究基因标记和细胞群的关系进行分析。
?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
Riferimenti
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