Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada
Summary
Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante.
Abstract
Proteossomas são encontrados em todos os domínios da vida. Eles fornecem a principal via de degradação da proteína intracelular em eucariotas, embora a sua montagem não está completamente esclarecido. Todos os proteasomas conter uma partícula estruturalmente conservada núcleo (CP), ou proteassoma 20S, contendo dois anéis de subunidade beta heptamérico imprensado entre dois anéis de subunidades α heptamérico. Archaea proteosomas 20S são de composição simples em comparação com os seus homólogos eucarióticos, ainda que ambos partilham um mecanismo de montagem comum. Consequentemente, Archaea proteosomas 20S continuam a ser modelos importantes para a montagem do proteassoma eucariótica. Especificamente, a expressão recombinante de 20s archaeal proteasomas juntamente com não desnaturante eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) rendeu muitos insights importantes sobre a biogênese proteassoma. Aqui, discutimos um meio para melhorar a estratégia habitual de co-expressão de α proteassoma e archaea subunidades p antes nondenaturing PAGE. Nós demonstramos que, embora rápida e eficiente, uma abordagem co-expressão por si só pode perder intermediários chave de montagem. No caso de o proteassoma, a co-expressão pode não permitir a detecção da meia-proteassoma, um contendo uma completa α-anel intermédio e uma completa β-anel. No entanto, este intermediário é facilmente detectado por meio de mistura lisado. Sugerimos que a combinação de co-expressão com mistura lisado produz uma abordagem que seja mais aprofundada na análise de montagem, ainda permanece nonintensive trabalho. Esta abordagem pode ser útil para o estudo de outros complexos multiproteicos recombinantes.
Introduction
Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas 1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem 2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular 4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) 5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por uma partícula de regulamentação 19S (RP) 6.
O proteassoma 20S é um grande protease compartimentada. A sua estrutura quaternária é absolutamente conservado em todos os domínios de vida e consiste de uma pilha de quatro anéis de sete membros contendo dois tipos de subunidades estruturalmente relacionadas, α; e p 5,7,8. Nos eucariotas, os dois anéis exteriores são cada um composto por sete sub-unidades a distintas, e os dois anéis interiores são cada um composto por sete subunidades p diferentes; actividade proteolítica reside dentro de três das subunidades p. Em contraste, os anéis de CP arquebactérias e bactérias são geralmente composta por apenas um tipo de α e um tipo de subunidade β. Proteasomas Arqueais forneceram um importante sistema modelo para estudar a montagem do proteassoma devido tanto à sua simplicidade de composição e sua partilha de um mecanismo de montagem comum com os seus homólogos eucarióticos 9-13. Em breve, subunidades a montar em anéis alfa em primeiro lugar, que servem como um andaime sobre o qual p subunidades montar. As meias-proteassomas resultantes (7 α β 7) dimerizar, dando origem a CP totalmente montado (α β 7 7 7 β α 7). Durante a dimerização, os pró-péptidos apresentar em subunidades psão autocataliticamente removida, expondo as treoninas N-terminais catalíticas. A utilização de proteossomas de arqueia para modelar montagem frequentemente leva vantagem de a produção de proteínas recombinantes de proteassoma de arqueia em Escherichia coli. Esta é uma abordagem útil porque permite que as subunidades a ser produzidos em várias combinações, como tanto a WT e versões mutantes, num organismo hospedeiro que não produz as suas próprias proteossomas.
Acompanhamento do conjunto de complexos multi-protéicos requer bioquimicamente algum tipo de método de fraccionamento que separa complexos totalmente montados a partir de intermediários de montagem e precursores. Devido à sua capacidade de resolução superior, não desnaturante em gel de poliacrilamida de electroforese (PAGE), tem provado ser especialmente úteis no fraccionamento de vários grandes complexos multiproteicos 14-17. A combinação de produção proteassoma archaeal recombinante e PAGE não desnaturante tornou-se uma abordagem poderosa em dissecting de montagem do proteassoma 9,11,12,18. No entanto, o método usual, através da qual esta abordagem é aplicada (isto é. Por meio da co-expressão recombinante de subunidades a e p) tem uma importante desvantagem. Reações de montagem são cooperativos e fortemente dependente da concentração 3. Dado que a concentração de proteínas no interior das células é muito alta 19, devido a efeitos de volume excluído, reacções de montagem proceder rapidamente in vivo. Por isso, é possível perder importantes intermediários de montagem quando aep subunidades são co-expressos.
Aqui, defendem uma abordagem combinada no estudo da montagem do proteassoma usando subunidades de proteassoma archaeal recombinantes. Nesta abordagem, ambos os métodos de mistura e co-expressão de lisado são empregues. O ex-permite a análise rápida de reunião, porque a co-expressão é menos trabalhosa. Este último depende da expressão separada de subunidades a e p, seguidos por mistura. Embora este requires um pouco mais esforço do que co-expressão, é mais do que compensada pela capacidade de detectar intermediários que são perdidas durante a co-expressão. Juntos, estes dois métodos podem fornecer um quadro mais completo de montagem do proteassoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos o benefício de uma abordagem combinada à análise de montagem do proteosoma pelo não desnaturante PAGE utilizando proteasomas archaeal recombinantes. O método usual de 9,11 a co-expressão bacteriana de subunidades de proteassoma permite a análise rápida mas pode não revelar intermediários chave de montagem. Sugerimos combinando co-expressão com ligado misturando a desenvolver um quadro mais amplo de eventos de montagem.
A vantagem desta abordagem combin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por uma fundos de apoio Grant Research (RSFG) da Universidade de Indiana University-Purdue, Indianapolis, e em parte por um prêmio da American Heart Association 14GRNT20390154, a ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Riferimenti
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