In linea Size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una SAXS Beamline

Summary

La determinazione della struttura in soluzione di una proteina da piccolo angolo X-ray Scattering (SAXS) richiede campioni monodisperse. Qui, vi presentiamo due possibilità per garantire ritardi minimi tra la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati: in linea cromatografia dimensione esclusione (SEC) e in linea cromatografia a scambio ionico (IEC).

Abstract

Biological piccolo angolo di diffusione dei raggi X (BioSAXS) è una tecnica potente in biologia molecolare e strutturale utilizzato per determinare struttura in soluzione, la dimensione delle particelle e la forma, e il rapporto superficie-volume di macromolecole. La tecnica è applicabile ad un'ampia varietà di condizioni di soluzione coprono un ampio intervallo di concentrazioni, valori di pH, forza ionica, temperatura, additivi, ecc, ma il campione deve essere monodisperse. Questo avvertimento ha portato alla realizzazione di sistemi di cromatografia liquida su linee di luce SAXS. Qui, descriviamo l'integrazione a monte di esclusione dimensionale (SEC) e cromatografia a scambio ionico (IEC) su una linea di luce, diversi metodi per sfondo ottimale sottrazione e riduzione dei dati. Come esempio, si descrive come utilizziamo SEC-e IEC-SAXS su un frammento della proteina essenziale del virus vaccinia D5, costituito da un dominio D5N elicasi. Noi determinare la sua forma complessiva e peso molecolare, che mostra la struttura esamerica di The proteine.

Introduction

BioSAXS è un potente strumento per determinare la forma degli oggetti di dimensioni nanometriche ^1-4. La dispersione di raggi X da una soluzione contenente macromolecole, dimensionate nell'intervallo nm, viene registrato ad angoli molto bassi. Questa gamma angolare contiene informazioni sui parametri globali: il raggio di rotazione; la massima distanza intraparticellare; la forma delle particelle; e il grado di piegatura, denaturazione, o disturbo. La tecnica non richiede cristalli, e la macromolecola rimane in soluzione e quindi possono essere tenuti in condizioni che mimano alcuni importanti parametri della cella, come la forza ionica, pH, ecc La conoscenza di questi fattori possono contribuire a determinare, per esempio, lo stato oligomerico fisiologicamente rilevanti di una proteina di interesse o per validare un progetto di modello di un complesso. La caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina in diverse condizioni di buffer, la creazione di modelli di domini mancanti, il perfezionamento di modelli di omologia, e decessazione di stati piegati e ripiegati discreti può essere eseguita rapidamente e facilmente ^5.

Come con qualsiasi tecnica, BioSAXS ha debolezze intrinseche: campioni aggregati o denaturati, miscele di particelle, campioni eterogenei, danni da radiazioni, e l'inadeguatezza del buffer può generare dati non-interpretabile. Per molti metodi di analisi, è implicitamente presume che il campione è monodisperse, un requisito che è spesso difficile da ottenere in pratica. In molti casi, la degradazione del campione è sottile e non può essere rilevato nei dati di propria, e qualsiasi tentativo di interpretare i dati dà risultati inaccurati o addirittura fuorvianti. Per superare questi ostacoli, la combinazione di cromatografia dimensione esclusione (SEC) e SAXS è stato implementato in molte linee di luce per garantire la qualità dei dati e per rendere questa tecnica più accessibile per i campioni sempre più difficili ^6-11. Recentemente, abbiamo aggiunto un nuovo metodo per il repertorio, sviluppando in linea a scambio ionicocromatografia (IEC) -coupled SAXS ^12. Entrambe le tecniche sono aprendo SAXS ad una vasta gamma di particelle biologiche precedentemente impossibili da analizzare. La scelta del metodo da utilizzare dipende dalle proprietà biofisiche delle particelle di interesse.

SEC separa macromolecole per la loro dimensione, per cui è necessaria almeno una differenza del 10% in massa molecolare apparente per la separazione. limitazioni fisiche della colonna e proprietà fisiologiche dei campioni, come superfici idrofobiche, la flessibilità, e la mancanza di stabilità, complicano anche la raccolta dei dati, l'analisi e l'interpretazione.

Cromatografia a scambio ionico, che separa le molecole in base alla loro carica e, quindi, la loro affinità di legame alla colonna IEC, può essere usato al posto di o in aggiunta a SEC. La carica totale può essere facilmente manipolata cambiando il pH, o variando la concentrazione salina del buffer, fornendo un metodo relativamente semplice per l'el controllataution delle molecole dalla colonna IEC. Utilizzando la carica, la separazione dei tipi simili e dimensioni di molecole, che altrimenti sarebbero difficilmente separabili, può essere effettuata di routine con IEC. Inoltre, IEC ha il vantaggio di essere in grado di trattare i campioni diluiti, permettendo di evitare le fasi di concentrazione, che portano il potenziale rischio di denaturazione della proteina. Purtroppo, come la distribuzione di carica è altamente dipende dal campione, IEC richiede ottimizzazione riguardante il pH e le concentrazioni saline ^13,14.

Per molte proteine ​​che sono difficili da esprimere, purificare, o entrambi, solo basse quantità di campione sono a disposizione per studiare. È importante essere efficiente e ridurre al minimo il numero di fasi di purificazione e, quindi, le perdite. Per questo motivo, l'ultima fase di purificazione è collegato direttamente prima acquisizione dati SAXS, al fine di aumentare la probabilità di raccogliere un buon insieme di dati.

Qui, Presentiamo e confrontare on-line SEC-SAXS e IEC-SAXS. Entrambe le tecniche sono state attuate sulla linea di luce BioSAXS BM29 alla European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) di Grenoble, Francia ^15. Come un banco di prova, abbiamo utilizzato il dominio D5N e elicasi della proteina del virus vaccinico D5, che era piuttosto difficile da analizzare strutturalmente con altri metodi. Il virus vaccino è un membro della famiglia Poxviridae ed è il 98% identico al virus Variola, la causa del vaiolo. Utilizzando il sistema di vaccino, si studia il meccanismo di replica, concentrandosi qui sull'essenziale D5 elicasi-primasi.

D5 è una proteina 95-kDa con un archeo-eucariote primasi (AEP) dominio N-terminale ¹⁶ seguito da un cluster regione cisteina (res. 240-345) ^16. Inoltre verso la C-terminale viene un dominio D5N (res. 340-460), che è sempre associata a D5 tipo elicasi, e, infine, una superfamiglia 3 (SF3) dominio elicasi (res. 460-785) ¹⁷ (Figure 1A). Il dominio elicasi di D5 costruisce una struttura ad anello esamerica che è necessario per stretto legame al DNA. Grazie a recenti studi SAXS e EM, le strutture a bassa risoluzione del primasi ei domini elicasi sono ormai noti ^18.

Qui vi mostriamo come utilizzare le tecniche di cromatografia in linea attuati sulla linea di luce BioSAXS BM29 a ESRF per acquisire conoscenze nella struttura del frammento C-terminale (residui 323-785) di D5.

Protocol

1. Descrizione del Offline Preparazione e generazione del campione di una proteina D5 Soppressione

NOTA: il D5 _323-785 costrutto (Figura 1A) è stato clonato, espresso e purificato come descritto ^18.

1. Clonare il costrutto nel vettore pProEx HTB
   1. Eseguire una reazione a catena della polimerasi (PCR) su D5R utilizzando i 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 primer 'e 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' e una miscela di reazione PCR con polimerasi, seguendo i consigli del produttore.
   2. Purificare i frammenti di PCR mediante colonne di rotazione, seguendo i consigli del produttore.
   3. Digerire i frammenti di PCR e il plasmide con il NcoI e enzimi di restrizione HindIII, seguendo le raccomandazioni del produttore per la composizione del buffer e il tempo di incubazione.
   4. Eseguire i frammenti su un gel di agarosio 1% in tampone TAE 0,5x (20 mM Tris, 10 mM di acido acetico,e 0,5 mM EDTA) e macchiare il gel con un colorante DNA.
   5. Esporre il gel ai raggi UV.
      Attenzione: Indossare dispositivi di protezione individuale! Tagliare le bande dei frammenti di PCR digeriti e il plasmide digerito e purificare il DNA utilizzando una purificazione gel kit di Spin Column, seguendo le raccomandazioni del produttore.
   6. Legare i frammenti di PCR purificati nel plasmide utilizzando un kit veloce legatura, seguendo le raccomandazioni del produttore.
   7. Transform tramite shock termico prodotto dalla reazione di ligasi in batteri competenti ottimizzati per l'amplificazione del plasmide.
      1. Aggiungere metà del prodotto legatura ad una fiala di batteri.
      2. Incubare la provetta di reazione in ghiaccio per 20 min.
      3. Incubare la provetta a 42 ° C per 30 s.
      4. Posizionare la provetta in ghiaccio per 2 min.
      5. Aggiungere 1 ml di Luria Bertani (LB) Broth (Miller) senza antibiotici e lasciare che le cellule recuperano a 37 ° C per 1 ora.
      6. Spin giù le cellule a 16.100 xg for 3 s in un microtubo centrifuga da tavolo e rimuovere la maggior parte del mezzo.
      7. Distribuire le cellule su una piastra di agar LB con ampicillina (50 ug / ml finale) e lasciare che le colonie crescere a 37 ° C durante la notte.
   8. Mettere una colonia in 3 ml di LB con ampicillina (50 mg / ml finale) e far crescere la cultura a 37 ° C, agitando a 160 giri al minuto durante la notte.
   9. Seguire le istruzioni del kit miniprep per estrarre il plasmide.
   10. Invia un campione del plasmide per il sequenziamento e analizzare la sequenza per l'assenza di mutazioni e del corretto inserimento.
   11. Trasforma il pProEx HTB D5 _323-785 costruire in batteri ottimizzati per l'espressione della proteina (utilizzare 1 ml e seguire la procedura descritta nella fase 1.1.7). Diffondere i batteri su una piastra di agar LB con ampicillina (50 mg / ml finale).
   12. Per creare una cultura di partenza, mettere una colonia in 300 ml di LB con ampicillina (50 mg / ml finale) e crescere i batteri a 37 ° C, agitando a 160 rpm durante la notte.
2. Seminare 12 x 1 L di LB in presenza di ampicillina (50 ug / ml finale), ciascuno con 20 mL di pProEx HTB D5 _323-785 batteri coltura starter a 37 ° C fino a una OD ₆₀₀ = 0.3 è raggiunto. Ridurre la temperatura a 18 ° C e indurre l'espressione in una OD ₆₀₀ = 0.5 con 1 mM IPTG. Incubare le culture, li agitazione a 160 giri al minuto e 18 ° C durante la notte.
3. Raccogliere i batteri per centrifugazione a 50.000 xg a 4 ° C per 30 min. Risospendere il pellet batterico in circa 150 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl _2, 10 mM β-mercaptoetanolo e 10% glicerolo) con l'inibitore della proteasi 1x e 25 unità ( U) / 10 ml DNasi. La lisi dei batteri tramite sonicazione su ghiaccio (sonda 1 pollice, 50% di potenza, 0,5-s impulsi, 0,5 s di pausa, 3x 5 min).
4. Caricare il surnatante su una colonna di nichel affinità (Ni-colonna, 1,5 mL volume del letto), e lavarlo con 10 volumi di colonna (CV) di Binding tampone (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoetanolo e 10% glicerolo), 10 CV di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-mercaptoetanolo e 10% glicerolo) e 10 CV di lavaggio imidazolo (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% glicerolo, 30 mM imidazolo). Eluire la D5 _323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% glicerolo, e 200 mM imidazolo).
5. Ispezionare le varie fasi di purificazione tramite sodio dodecil solfato (SDS) elettroforesi su gel -polyacrylamide (PAG).
   1. Carico 2-20 ml di ciascuna fase di purificazione flow-through miscelato con 1x loading dye (2x: 4% SDS, 20% glicerolo, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8], e il peso 0,02% / volume di blu di bromofenolo) su 10 % SDS gel e li funzionare a 200 V in 1x Laemmli tampone di corsa (25 mM Tris, 0,192 M glicina, e 0,1% SDS).
   2. Macchia il gel con una soluzione di blu di Coomassie pronta all'uso.
6. Ecchange il buffer della proteina eluita con binding buffer utilizzando una colonna dissalazione in base al manuale del costruttore.
7. Fendere l'His-tag aggiungendo Tobacco Etch Virus nucleare inclusione-a endopeptidasi (TEV, 1 mg / 100 mg di proteina) alla soluzione proteica. Incubare a temperatura ambiente per una notte.
8. Controllare la digestione eseguendo SDS-PAGE (vedi punto 1.5)
9. Equilibrare il Ni-colonna nel buffer di legame. Lasciate che la soluzione proteica passare attraverso e lavare le perline con 2 CV di tampone di lavaggio imidazolo, mentre la raccolta del flusso continuo.
10. Concentrare la proteina utilizzando un concentratore centrifugo ad un volume finale di 0,5 mL.
11. Iniettare la proteina concentrata su una colonna di esclusione dimensionale equilibrata con tampone di gel filtrazione (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glicerolo, e 1 mM di ditiotreitolo [DTT]).
12. Raccogliere il flusso continuo in 0,5 mL frazioni.
13. Controllare la presenza e la purezza della proteina nei campioni di piccol'esecuzione di SDS-PAGE (vedi punto 1.5).
14. Unire le frazioni del picco eluito della D5 _323-785. Diluire il campione a 25 mM NaCl e 5% glicerolo mantenendo le concentrazioni Tris e DTT costante (per 5 ml di soluzione proteica in 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glicerolo, e 1 mM DTT, prima aggiungere 5 ml di 20 mM Tris-HCl [pH 7] e 1 mM DTT, e quindi aggiungere 20 ml di 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% glicerolo, e 1 mm DTT).
15. Caricare il campione in una colonna a scambio ionico. Utilizzare tampone A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glicerolo, e 1 mM DTT) e tampone B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% glicerolo, e 1 mM DTT) per formare un gradiente salino da 25 mM a 1 M.
16. Raccogliere la proteina eluita in 1,5 mL frazioni.
17. Controllare la presenza e la purezza della proteina nei campioni picco eseguendo SDS-PAGE (vedere fase 1.5 e Figura 1B)
18. Riconcentrate la soluzione proteica in un concentratore centrifugo ad un volume finale di 0,5 mL.
19. Rerun proteina concentrata su una colonna ad esclusione dimensionale in tampone per gel filtrazione (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glicerolo, e 1 mM DTT; vedere il punto 1.11).

2. Raccolta dati

NOTA: Richiesta tempo trave il più presto possibile. Per ESRF, le linee guida sui tipi di accesso disponibili e su come presentare una domanda sono disponibili all'indirizzo:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Dopo l'accettazione della proposta e un invito per l'esperimento, tutti i partecipanti devono completare una formazione sulla sicurezza. Dopo la convalida della formazione, compilare il "modulo A-" (attraverso il portale utente ESRF) di dichiarare i ricercatori in visita alla linea di luce per l'esperimento, insieme con le informazioni di sicurezza necessarie sui campioni. Contattare la persona di contatto locale per discutere l'esperimento.

1. La raccolta dei dati SEC-SAXS
   NOTA: per onlpurificazione ine, utilizzare il sistema ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) installato a BM29. Il sistema è costituito da un sistema di degasaggio in linea, una pompa binaria, una valvola per la selezione buffer e gradienti, un autocampionatore, una matrice photospectrometer UV-VIS e un conduttometro. E 'direttamente collegato al capillare flow-through della unità di esposizione SAXS ^19.
   1. Mettere 1 ml di tampone di gel-filtrazione da parte. Collegare il flacone di soluzione tampone al sistema SEC (l'impostazione predefinita è Port A).
   2. Scegliere la portata seconda colonna in uso. Nota: Per la colonna esclusione dimensionale qui utilizzato, la velocità di flusso di 0.1 mL / min. Definire la pressione massima per la colonna, prendere nota della contropressione, e impostare il tempo di acquisizione di almeno 1,2 CV.
   3. Lavare le pompe e dei tubi a monte tramite la funzione "auto-spurgo".
   4. Attendere il sistema viene riempito con il tampone e collegare la colonna. Equilibrare la colonna facendo passare almeno 1,5 CV.
   5. interbloccola gabbia e misurare il buffer di mettere da parte al punto 2.1.1, con il campionatore per controllare la variazione del segnale a causa di danni da radiazioni. Solo continuare se non ci sono danni radiazioni al buffer.
   6. Spegnere il sistema di controllo linea di luce in modalità HPLC. Effettuare un test di tampone, raccogliendo 200 fotogrammi con 1 s per fotogramma. Annotare il numero di conteggi forniti dal rivelatore nella trama intensità sommati.
      NOTA: Il segnale dovrebbe corrispondere buffer precedentemente misurato, e l'intensità sommati nel tempo deve rimanere costante. Se il segnale non corrisponde o non è costante, è necessario un equilibrio più lunghi del sistema.
   7. Centrifugare il campione a 13.000 xg in una centrifuga da tavolo microtubo per almeno 10 min.
   8. Riempire il campione in una fiala di vetro HPLC-compatibile (in dotazione) e metterlo in autoiniettore. Notare la posizione bene.
   9. Intrecciare le hutch sperimentale utilizzando procedure standard, come spiegato nella formazione sulla sicurezza per l'utente.
   10. Accedere e creare una cartella per la memorizzazione dei dati tramite il software di controllo linea di luce.
   11. Programmare il sistema HPLC utilizzando il "lotto rapida" caratteristica. Impostare la posizione di archiviazione per i dati UV nella cartella creata nel passaggio 2.1.10. Assicurarsi di attivare la conversione ASCII automatica dei dati UV, memorizzare il file ASCII nella stessa cartella.
       1. Scegliere il volume di iniezione e la posizione bene. Aggiungere la misura alla coda premendo il pulsante "Start". Il software vi chiederà di salvare il batch. Preparati per il salvataggio, ma non premere il pulsante "Salva", in quanto questo si avvia automaticamente la misurazione.
   12. Impostare i parametri di raccolta dei dati nel software di controllo linea di luce. Scegliere il numero di fotogrammi in modo che il tempo totale di raccolta dei dati è in leggero eccesso del tempo di acquisizione definito nel passaggio 2.1.2.
   13. Aprire l'otturatore di sicurezza e di avviare la raccolta di dati SAXS utilizzando il software di controllo linea di luce. Verificare che i dati siano correttamente acquisito. Confrontare i dati appena raccolti i dati raccolti nella fase 2.1.6 e verificare che il numero di conteggi di intensità sommati rimane costante per almeno 100 fotogrammi e corrisponde al valore dal punto 2.1.6.
       1. Avviare il SEC eseguito premendo il pulsante "Salva", come preparato al punto 2.1.11, e prendere nota del numero di fotogramma visualizzato nel software camserver quando l'iniezione è stata completata e l'acquisizione dati UV inizia.
   14. Dopo la raccolta di dati, aprire il database ISPyB ²⁰ a Aprire la scheda "acquisizione dati" e premere il tasto "Go" per accedere al set di dati e dei risultati delle analisi automatica ^21.
2. La raccolta di dati IEC-SAXS
   NOTA: Invece di gradiente lineare continuo comunemente applicato in esperimenti IEC, utilizzare un gradiente graduale in cui la quantità di tampone B viene aumentato a passi discreti preimpostati.
   1. Creare il programma HPLC per un sample-Free Run buffer. Programmare un gradiente graduale a partire da 0% tampone B e l'aumento di 5 punti percentuali, dopo due CV fino a raggiungere il 100% di tampone B.
   2. Mettere un po 'di ogni buffer da parte. Collegare il flacone con il tampone basso contenuto di sale A alla porta A e quello con il buffer alto sale B alla porta B.
   3. Scegliere la portata e rimanere sotto il limite di pressione della colonna (in questo esempio, 1 mL / min).
   4. Come al punto 2.1.3, lavare le pompe e tubi a monte utilizzando la funzione "auto-spurgo".
   5. Equilibrare il sistema a basso contenuto di sale tampone A (vedi punto 1.15) e collegare la colonna a scambio ionico. Attendere che la colonna è completamente equilibrata (almeno 1,5 CV).
   6. Utilizzare il buffer di mettere da parte al punto 2.2.2 per esaminare i buffer A e B per danni da radiazioni utilizzando il scambiatore di campioni, come al punto 2.1.5.
   7. Controllare il buffer proveniente dalla colonna, come al punto 2.1.6. Confrontare il segnale per il segnale di tampone A registrata nel passaggio 2.2.6. Nota di nuovo ilnumero di conteggi nella trama intensità sommati.
   8. Creare una cartella per la memorizzazione dei dati per la corsa del buffer.
   9. Impostare la raccolta dei dati in modalità sistema HPLC. Scegliere il numero di fotogrammi in modo che il tempo totale di raccolta dei dati è in eccesso del tempo totale della corsa IEC (vedere fase 2.2.1).
   10. Aprire l'otturatore di sicurezza e avviare la raccolta dei dati SAXS. Verificare che procede correttamente e doppio verificare che l'intensità sommato rimane costante al valore indicato nel passaggio 2.2.7 per almeno 100 fotogrammi.
   11. Utilizzare la funzione "Single Run" del software HPLC e avviare il gradiente graduale programmato al punto 2.2.1. Per l'iniezione, impostare il numero di vial a -1 per iniettare nessun campione in questa fase. Annotare il numero di fotogrammi acquisiti come il programma si avvia.
   12. Creare il programma HPLC per la corsa del campione. Programmare un gradiente graduale a partire da 0% di tampone B. Stima la percentuale di tampone B ad ogni picco misurata non in linea nel passaggio 1.1.5 ( Figura 1B). Impostare almeno 3 passaggi esattamente 1 punto percentuale al di sotto e 1,5 punti al di sopra dei picchi di interesse, ciascuno per 2,5 CV (Figura 1C). Aggiungere un ultimo passaggio al 100% tampone B per 2,5 CV.
   13. Centrifugare il campione a 13.000 xg in una centrifuga da tavolo microtubo per almeno 10 min.
   14. Diluire D5 _323-785 nella concentrazione salina di tampone A (25 mM) mescolandolo con 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% glicerolo, e 1 mM DTT.
   15. Caricare il campione manualmente sulla colonna. Mettere il buffer Un tubo di ingresso nel campione diluito dopo una pausa le pompe per evitare la formazione di bolle d'aria. Scollegare la colonna dai rivelatori di raccogliere direttamente il flusso passante dalla colonna.
       1. Quando il contenitore del campione è quasi vuota, restituire il tubo di ingresso nel buffer A (nuovo pausa pompe durante lo spostamento del tubo) e riavviare il pompaggio con tampone A per trasferire il campione dal tubo alla colonna. Una volta che l'intero campione è statocaricato, passare 2 CV di tampone A, e quindi ricollegare la colonna ai rivelatori.
   16. Per la corsa del campione, creare una cartella per la memorizzazione dei dati.
   17. Aprire l'otturatore di sicurezza e avviare la raccolta dei dati SAXS. Verificare che la raccolta di dati procede correttamente e doppio verificare che l'intensità sommato rimane costante al valore indicato nel passaggio 2.2.7 per almeno 100 fotogrammi.
   18. Utilizzare la funzione "Single Run" del software HPLC per avviare il gradiente graduale programmato al punto 2.2.12. Per l'iniezione, impostare il numero di vial a -1 per iniettare nessun campione in questa fase. Annotare il numero di fotogrammi acquisiti come il programma si avvia.
   19. "Acquisizione dati" Open in ISPyB ²⁰ e premere "Go" per guardare il set di dati e l'analisi automatica ^21.
   20. Esportare i dati UV dal sistema HPLC al formato ASCII attraverso il software "Analisi Postrun".

3.SEC-SAXS Data Reduction e analisi

1. Aprire i dati di acquisizione dei dati in ISPyB premendo il pulsante "Vai". Determinare nella panoramica che incornicia della raccolta dati SAXS corrispondono al picco di eluizione. Verificare che il raggio della rotazione è stabile fino alla vetta.
2. Verificare che la correzione del buffer automatizzata è stata eseguita correttamente. Telai di carico dalla parte centrale del picco in un programma che esegue le manipolazioni con i dati sperimentali SAXS file ²² e medio. Quindi, caricare il file di buffer generato automaticamente e verificare se le regioni di alta q dei telai mediate e la partita cornici tampone.
3. Confronta i fotogrammi acquisiti durante il picco quantitativamente utilizzando il test CORMAP ^23.
   1. Caricare le sottrazioni creati automaticamente (file * _sub.dat) di frame che coprono la regione di interesse.
   2. li Scala all'altro premendo il tasto "Scale".
   3. Comparvia e utilizzando la funzione "Dati di confronto". Non ci dovrebbero essere variazioni sistematiche tra le cornici di tutto il picco.
4. Aperto tutti * -_ fotogrammi sub.dat di interesse, unirli utilizzando il pulsante "Unisci" e salvare il file unito in formato .dat.
5. Determinare il raggio di girazione con funzione "raggio della rotazione" nel programma, notando il primo punto dati nell'intervallo Guinier per dopo ritaglio dei dati a bassa risoluzione.
6. Determinare la funzione di distribuzione coppia di distanza con lo strumento "Distanza di distribuzione" nel programma e salvare il file risultante come .out gnom.out.

4. ab initio Modeling

1. Su una macchina Unix, eseguire un programma di ricostruzione 40 x ab initio modello, senza restrizioni di simmetria. Creare una nuova cartella e copiare il file gnom.out ad esso. Eseguire il programma come segue:
   for ((i = 1; i <= 40; i ++)); fare dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; duno
2. Analogamente, eseguire un programma ab initio modello di ricostruzione con restrizioni di simmetria per la simmetria di sei volte in una seconda cartella:
   for ((i = 1; i <= 40; i ++)); Do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; fatto
3. Allineare tutti i file di output programma ab initio modello di ricostruzione (* -1.pdb). Nelle due cartelle da passi 4.1 e 4.2, eseguire damaver -a * -1.pdb.
4. Aprire l'unione di tutti i modelli (damaver.pdb) e il modello filtrato al volume corretto (damfilt.pdb) in un adatto software di visualizzazione molecolare ²⁶ e confrontarli.
5. Aprire il file damsel.log in un editor di testo. Il modello indicato come il "riferimento" nella parte inferiore del file è il modello più rappresentativo.

5. IEC-SAXS Data Reduction, l'analisi e la modellazione

1. Nel programma che esegue la manipolazione con i file di dati sperimentali SAXS ^22, caricare circa 50 SAXS fotogrammi da ciascuna fase di miscelazione dila corsa del buffer, premere il pulsante "medio", e salvare i risultati.
2. Sulla base dei risultati auto-elaborazione disponibili tramite ISPyB, identificare quale inquadra dell'esperimento corrisponde alla eluizione della proteina e verificare che il (preliminare) del raggio di girazione è stabile durante il picco.
3. Caricare i fotogrammi nel programma sperimentale file di dati di manipolazione SAXS ²² e media, come fatto per i telai tampone (vedi punto 5.1). Poi, caricare i file di buffer generati nella fase 5.1 e confrontare le regioni ad alto Q (sopra 4,2 nm ^-1) per trovare un buffer che corrisponde alla media dalla vetta.
   NOTA: Non ci dovrebbero essere compensati tra la media dalla vetta e il buffer sistematica. Se la curva campione sembra cadere tra due curve di buffer, interpolare loro curve calcolando la media.
4. Sottrarre il buffer identificato come il miglior match dalla curva media dispersione della frazione di picco e salvare il risultante subtrFile agito. Inoltre, creare curve sottratte utilizzando le curve medie buffer dalla precedenti e seguenti fasi di miscelazione per stimare il margine di errore della sottrazione.
5. Ripetere i punti 5.3 e 5.4 individualmente per le metà destra e sinistra del picco e confronta i risultati a quelli dal punto 5.4 per verificare la stabilità del segnale in tutto il picco.
6. Seguire i passi 3.5 e 3.6 per tutte e tre le curve sottratto dal punto 5.4.
7. Confrontare i risultati per tutte e tre le curve sottratti.
   Nota: Solo i risultati che rimangono robusti all'interno del margine di errore di sottrazione si può fidare.
8. Eseguire la modellazione come nei passi 4.1 e 4.2 per il miglior sottrazione identificata nella fase 5.3.
9. Seguire il passaggio 4,3-4,5 per allineare i modelli e per individuare quella più rappresentativa.

6. confronto dei risultati

1. Eseguire un programma per sovrapporre strutture 3D ¹² sui modelli rappresentativi del SEC (passo 4.5) undati d IEC-SAXS (punto 5.9) con P6 simmetria: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
2. Importare il model_sec.pdb e la model_iec-r.pdb in un software di visualizzazione molecolare.
3. Aprire i file .fir del modelsec.pdb e la modeliec-r.pdb in un foglio di calcolo e creare un grafico 2D di curve sperimentali e calcolati di scattering.

Results

I risultati dell'analisi invariante model-free sono elencati nella Tabella 1. L'analisi dei dati di _323-785 D5 SEC-SAXS mostrava una stima massa molecolare (da un'analisi Porod) di 345 kDa contro 338 kDa, osservata utilizzando IEC-SAXS. Entrambi sono in accordo con la massa prevista del 6 volte 53,5 kDa (321 kDa) per un esamero. Il initio modellazione ab di entrambi i set di dati è stata intrapresa senza simmetria imposta (SEC-SAXS: χ ² = 0,88, IEC-SAXS: χ ² = 3.1) e l'utilizzo di C6 simmetria (SEC-SAXS: χ ² = 1.0, IEC-SAXS : χ ² = 4). Come le crisi globali ai dati di scattering per entrambe le ricostruzioni sono paragonabili in entrambi i casi (Figura 1D ed E), C6 simmetria può essere assunto. Pertanto, il modello corrisponde ad una struttura a forma di cono esagonale con un canale centrale, che appare parzialmente ostruita (SEC: Figura 1F; IEC: Figura 1 H). Un esame dei singoli modelli prima media mostra che questa ostruzione è probabile che sia un artefatto del processo di media.

Figura 1: analisi dei dati SAXS e confronto delle D5 _{323 -785} (figura adattato da riferimenti 12 e 18). A) la struttura del dominio schematica di D5 e D5 proteine _323-785. B) Non connesso a scambio ionico cromatogramma con l'indicazione delle tre cime. Arancione curva: assorbanza a 280 nm (au), curva blu: percentuale di tampone B. Percentuali di tampone B le cime sono indicati. C) Online cromatogramma a scambio ionico. chiave colore come in B. Inoltre, l'intensità misurata è indicato in verde. La dispersione sperimentale curva AND curva del modello ottenuto dal SEC-SAXS D) e IEC E) l'analisi dei dati di D5 _323-785 calcolato. Modello F) Perle di D5 _323-785 sulla base dei dati SEC e dati G) IEC. H) Sovrapposizione dei modelli SEC e IEC. I pannelli in F) ah) sono stati creati utilizzando un software di visualizzazione molecolare ^24. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Parametri di raccolta dati
Strumento:	ESRF BM29
Lunghezza d'onda (Å)	0.99
q-gamma (A -1)	,0032-,49
Campione-to-rilevatore distanza	2.864 m
Tempo di esposizione (sec)	1 per fotogramma
intervallo di concentrazione	n / a
Temperatura (K)	293
Rivelatore	Pilatus 1M (Dectris)
Flux (fotoni / s)	1 × 10 12
Dimensione del fascio (micron 2)	700 × 700
Parametri strutturali per D5 323-785, SEC
I 0 (cm -1) [da Guinier]	0,0237
Rg (Å) [da Guinier]	48
q min R g - q max R g utilizzato per Guinier	0,77-1,24
D max (Å) [da p (r)]	145
q-gamma utilizzato per p (r) (a -1)	0,02-0,17
Porod volume V p (a 3) [da Scatter]	(570 ± 5) 3 × 10
Massa molecolare M R (kDa) [da V p]	345
Calcolato monomerico Mr dalla sequenza (kDa)	321
Parametri strutturali per D5 323-785, IEC
I 0 (cm -1) [da Guinier]	0,386
Rg (Å) [da Guinier]	46.5 ± 0.1
q min R g - q max R g utilizzato per Guinier	0,44-1,29
D max (Å) [da p (r)]	120
q-gamma utilizzato per p (r) (a -1)	,03-0,18
Porod volume V p (& #197; 3) [da Scatter]	(577 ± 5) 3 × 10
Massa molecolare M R (kDa) [da V p]	339
Calcolato esamerica Mr dalla sequenza (kDa)	321

Tabella 1: SAXS parametri dei dati. La tabella riassume i parametri di acquisizione dati SAXS e analisi.

Discussion

Per molti macromolecole, una fase finale di purificazione mediante cromatografia è richiesto prima raccolta dati SAXS per ottenere un buon insieme di dati di qualità. Tuttavia, non tutti i campioni rimangono stabili; essi possono essere soggette a aggregazione o riequilibrio ad una miscela di stati di oligomerizzazione. Pertanto, una fase di purificazione finale online sulla linea di luce per ridurne al minimo il tempo tra purificazione e la raccolta di dati al fine di ottenere i dati SAXS migliore qualità. A seconda delle proprietà biofisiche della proteina di interesse, SEC-SAXS o IEC-SAXS potrebbero essere scelti per ottenere la qualità del campione ottimale. Qui, su un costrutto proteina derivata dalla elicasi / primasi D5, entrambe le tecniche sono spiegate e discusse.

Acquisizione dei dati SEC-SAXS sta diventando sempre più standardizzato ed è disponibile su molti BioSAXS linee di luce. L'analisi dei dati, in particolare la sottrazione dello sfondo, è relativamente semplice e facile. Tuttavia, un segnale di buffer stabilee la separazione sufficiente delle specie macromolecolari rimane essenziale. Pertanto, è fondamentale riservare tempo sufficiente per equilibrare fondo colonna. In mancanza di questo metodo può essere dovuto a contaminanti persistenti di dimensioni simili alla proteina di interesse, basse concentrazioni, e buffer sensibili alle radiazioni.

In pratica, inizialmente, SEC-SAXS è suscettibile di essere utilizzato come metodo di scelta per la maggior parte dei campioni macromolecolari. Tuttavia, molti protocolli di purificazione richiedono una fase IEC prima a causa della presenza di contaminanti o aggregazione. Dato che ogni fase di concentrazione e la cromatografia è associata a perdite di campione (stimata al 30-50%) e il tempo, diretta IEC-SAXS è vantaggioso. Per i campioni che non possono essere purificati mediante SEC, sia per la presenza di "contaminanti" di dimensioni simili o perché gravemente aggregato alle concentrazioni necessarie, IEC-SAXS sarebbe sempre essere l'approccio più adatto. Inoltre, le portate superiori supportatida molti colonne IEC possono contribuire a ridurre il tempo di transito tra la purificazione e di misurazione. Nell'esempio qui presentato, IEC è stato usato con una eluizione passo, che consente la separazione degli stretti picchi di D5 _323-785 da contaminanti scegliendo accuratamente i passi concentrazione salina. In linea di principio, il numero di passi è illimitato, ma praticamente, è richiesto almeno 1 punto a picco, e non troppi deve essere scelto. Per il metodo di sottrazione dello sfondo descritto sopra, è essenziale misurare un numero relativamente elevato di differenti composizioni tampone al fine di trovare una corrispondenza.

Un aspetto negativo condiviso di entrambe le tecniche è la mancanza di informazioni precise concentrazione proteica. A causa di questo, precisa determinazione della massa sulla base di dispersione in avanti non è possibile. Per proteine globulari come D5 _323-785, il volume Porod fornisce un'alternativa, anche se meno precisa, stima di massa, ma per proteine altamente flessibili o disordinate, Questo approccio non sarebbe valido.

Una variazione del gradiente graduale metodo IEC-SAXS qui presentato è l'uso di un gradiente lineare invece. Mentre è possibile lavorare con altrettante fasi come desiderato per isolare i sotto-picchi utilizzando una eluizione graduale, nell'approccio gradiente lineare, è necessario ottimizzare attentamente le condizioni di gradiente per separare i picchi completamente prima di iniziare il SAXS sperimentare. Sfondo sottrazione in questo approccio potrebbe essere fatto frame-saggio e potrebbe essere verificata dal confronto tra i singoli fotogrammi, ma richiede una gestione dei dati più avanzata, e un software dedicato non esiste ancora.

La scelta di una colonna adatta è fondamentale per entrambe le tecniche, in quanto determina la separazione delle specie macromolecolari. colonne esclusione dimensionale differiscono per capacità di carico, la gamma di dimensioni di macromolecole separabili, e la risoluzione, mentre le colonne a scambio ionico variano nel tipo e la densitàdelle loro cariche immobilizzati.

Mentre il protocollo presentato qui è specifico per la linea di luce ESRF BM29, l'adattamento a qualsiasi altra linea di luce SAXS è, in linea di principio, semplice. I requisiti principali sono sufficientemente elevato flusso di raggi X ed un rivelatore adatto (idealmente singolo conteggio di fotoni), per acquisire dati ragionevoli segnale-rumore nell'intervallo di secondi o meno, e un sistema di cromatografia liquida linea capace di creare gradienti. L'implementazione esatta, naturalmente, dipendono dall'ambiente linea di luce locale.

I risultati ottenuti sul D5 _323-785 utilizzando i due metodi differiscono leggermente. Il raggio di girazione è leggermente più piccolo per i dati IEC che per i dati SEC, e minimi locali della curva di dispersione siano spostate verso leggermente più grandi vettori di scattering. Ciò significa che il D5 _323-785 misurata con IEC-SAXS è leggermente più compatto del D5 _323-785 misurata con SEC-SAXS. Questo potrebbe be causa di differenze nella preparazione del campione, nel tempo fra purificazione e misura (IEC è più veloce), o, meno probabilmente, ad un contaminante nel campione SEC-purificato. I modelli di perline ottenuti in maniera completamente indipendente con entrambi i metodi sono confrontabili (Figura 1 H). D5 _323-785 mostra la cava, la struttura esamerica previsto ^18.

In conclusione, in linea a scambio ionico e in linea cromatografia dimensione esclusione sono importanti metodi di purificazione biochimici che possono essere accoppiati direttamente al SAXS ^{6,7,9-12,25,26.} Lo sfondo sottrazione dei dati IEC-SAXS è leggermente più difficile e ambiguo che per SEC-SAXS, ma è comunque possibile. A seconda delle proprietà biofisiche della proteina di interesse, sia SEC e IEC-SAXS permettono l'ottimizzazione della separazione specie con vantaggi intrinseci. Fornire motto di spirito che siano correttamente rispettate le fasi di validazione (come descritto), i dati risultanti possono essere analizzatih fiducia, ed i modelli possono essere determinati utilizzando gli strumenti standard disponibili all'interno della comunità. Insieme, entrambe le tecniche consentono la separazione in linea per una vasta gamma di macromolecole biologiche, ottenendo dati non accessibili tramite misurazioni statiche standard.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ditiotreitolo [DTT]	Euromedex	EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Gel proteico prefabbricato	Biorad	4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix	ThermoFisher scientifico	F 548
acido acetico glaciale	VWR Chemicals (BDH Prolabo)	20104.298
Agarosio D-5	Euromedex	LF45130653
Filtri centrifughi Amicon Ultra -15 Ultracel -30K	Millipore Ltd	UFC903024
Ampicillina sale sodico	Euromedex	EU0400-D
Benzonasi	Novagene	70750-3
blu bromofenolo.	MERCK	8122
Cocktail completo di inibitori della proteasi	Roche	11231400
Econo-Pac 10 DG Colonna di desalinizzazione	Bio-rad	732-2010
EDTA	Sigma	E-5134
Glicerolo	VWR Chemicals (BDH Prolabo)	24388.295
Glicina	Euromedex	26-128-6405-C
HindIII	Roche	656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel	Sigma	H0537
Acido cloridrico (HCl)	VWR Chemicals (BDH Prolabo)	20252.295
Imidazole	AppliChem Panreac	A1073,0500
InstantBlue	Expedeon	ISB1L
LB brodo Miller	Fluka Analytical	L3152
MgCl2	ICN Biomedicals Inc.
NaCl	VWR Chemicals (BDH Prolabo)	27808.297
NcoI	Fermentas	ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)	ThermoFisher scientific	C6010-03
pProEx HTb vettoriale	Addgene	10711018
Primer	nbsp; Eurofins mwg operone
QIAprep Spin Miniprep kit	QIAGEN	27106
QIAquick Kit di estrazione del gel	QIAGEN	28706
QIAquick PCR purificazione kid	QIAGEN	28106
SDS	Sigma	75746
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
SYBR Colorazione sicura del gel del DNA	Tecnologia della vita Invitrogen	S33102
T4 ligasi	ThermoFisher scientific	EL0011
TEV			fatto in casa
TOP 10	Invitrogen life technology	C404003
Base Tris	Euromedex	26-128-3094-B
Uno Q 1R colonna	Bio-rad	720 0011
β-mercaptoetanolo	MPBiomedicals, LLC	194834
Name	Company<	strong>Numero di catalogo	Comments
Softwares
Software di controllo della linea di luce BsXCuBE	ESRF	Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664	sviluppo locale
Software Camserver	Dectris	n.a.software	di controllo del rivelatore
DAMAVER	ATSAS 2.6.0	http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html	programma per allineare i modelli ab initio
DAMMIF	ATSAS 2.6.0	http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html	ab initio programma di ricostruzione del modello
Programma HPLC Biologic Duo Flow	Bio-rad
Programma HPLC LabSolutions	Shimadzu	n.a.ISPyB
	ESRF	De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.	Sviluppo locale
PRIMUS	ATSAS 2.6.0	http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html	programma, che esegue la manipolazione con SAXS sperimentale
PyMOL	DeLano Scientific LLC		https://www.pymol.org/ software per la visualizzazione
SUPCOMB	ATSAS 2.6.0	http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html	programma per sovrapporre strutture 3D
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow	Biorad
BioLogic Biofrac Raccoglitore di frazioni	Biorad
Sistema HPLC	Shimadzu
Labsonic P	Sartorius Stedim biotech	BBI8535108