بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.
Abstract
الكهربي فحوصات التنقل العالي (EMSA) هي أداة مفيدة لتوصيف التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي المستهدفة. وكان النشاط الإشعاعي الطريقة السائدة لوضع العلامات الحمض النووي في EMSAs. ومع ذلك، فقد دفعت التطورات الحديثة في مجال الأصباغ الفلورية وطرق مسح استخدام العلامات الفلورية من الحمض النووي كبديل للنشاط الإشعاعي للمزايا سهولة التعامل، وتوفير الوقت وتقليل التكاليف، وتحسين السلامة. وقد استخدمنا مؤخرا EMSA فلوري (fEMSA) لمعالجة مسألة البيولوجي المهم بنجاح. يوفر تحليل fEMSA لدينا البصيرة الميكانيكية في تأثير طفرة مغلطة، G73E، في الحفظ جدا HMG عامل النسخ SOX-2 على حاسة الشم تنويع نوع الخلايا العصبية. وجدنا أن متحولة SOX-2 البروتين G73E يغير النشاط ملزم DNA محددة، وبالتالي التسبب في حاسة الشم التحول هوية الخلايا العصبية. هنا، نقدم على الوجه الأمثل، وفعالة من حيث التكلفة خطوة بخطوة بروتوكوللfEMSA باستخدام الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ يحتوي على LIM-4 / SOX-2 المجاورة المواقع المستهدفة والنقاء SOX-2 البروتينات (WT ومتحولة SOX-2 البروتينات G73E) كمثال البيولوجي.
Introduction
تستخدم EMSAs لتحليل التفاعلات بين الحمض النووي والبروتينات باستخدام الأصلي إس دي إس بايج (PAGE) لحل خليط من البروتين من الفائدة وتحقيق الحمض النووي المسمى تحتوي على المواقع المستهدفة المحتملة من البروتين 1. مسبار الحمض النووي ملزمة مع البروتين سوف يهاجرون أبطأ مقارنة مع التحقيق الذي تجريه الحمض النووي الحرة، وبالتالي فهو متخلف في الهجرة من خلال مصفوفة بولي أكريلاميد. وقد Radiolabeling من الحمض النووي بنسبة 32 P الطريقة السائدة للكشف في EMSAs. على الرغم من أن تطبيق radiolabeling في بحوث الكيمياء الحيوية كان مفيدا، يتم استخدام طرق وضع العلامات الحمض النووي بديل مع حساسية مقارنة نظرا لمخاطر الصحة والسلامة المرتبطة التعامل مع النشاط الإشعاعي. وتشمل هذه الطرق البديلة الاقتران من الحمض النووي مع البيوتين 2 أو digoxigenin (DIG) 3 (وكلاهما ثم يتم الكشف عنها بواسطة أنظمة chemiluminescent)، SYBR تلطيخ الأخضر من المواد الهلامية PAGE 4،أو الكشف المباشر لتقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت عن طريق مسح 5،6 هلام.
تتطلب المواد الهلامية حلها من EMSAs باستخدام اختبار الحمض النووي DNA المسمى بالإشعاع معالجة postrun من خلال أفلام تصوير الإشعاع الذاتي أو نظام phosphorimager للكشف عن الإشارات المشعة 1،7. المواد الهلامية من EMSAs باستخدام biotin- 2 أو DIG مترافق تحقيقات 3 الحمض النووي يجب أن تتم معالجة ونقل على غشاء مناسبة ومن ثم الكشف عن طريق التوهج 6. SYBR تلطيخ الأخضر من هلام يتطلب postrun تلطيخ جل وماسح ضوئي الفلورسنت 4. منذ مطلوبة خطوات المعالجة هلام postrun لEMSAs باستخدام تقنيات وضع العلامات الحمض النووي هذه، وهلام حل يمكن يعاير مرة واحدة فقط. في المقابل، تحقيقات الحمض النووي المسمى مع fluorophores يمكن الكشف مباشرة في هلام داخل ألواح الزجاج عن طريق الماسح الضوئي. ولذلك، فإن تفاعلات الحمض النووي والبروتينات يمكن رصدها ويعاير عدة مرات في نقاط زمنية مختلفة خلال الفترة السابقة، والتييقلل كثيرا من الوقت والتكلفة. تقارن صبغ الحمض النووي الفلورسنت التي استخدمت لEMSAs تشمل و Cy3 6،8، 6،8 Cy5، فلوريسئين 9، والأصباغ الفلورية الأشعة تحت الحمراء 4-6.
يتطلب تنظيم النسخي تفاعلات البروتين الحمض النووي من عوامل النسخ والجينات المستهدفة. التنسيق بين هذه التفاعلات يولد أنواع الخلايا المتنوعة من سلف مشترك خلال تطوير الحيوانية. حددت شاشة الوراثية إلى الأمام مشاركات طفرة مغلطة، G73E، في مجال الحمض النووي ملزم HMG الحفظ جدا من انواع معينة عامل ايليجانس النسخ SOX-2. نتائج طفرة في التحول هوية خلية من الخلايا العصبية الشمية AWB في الائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية الشمية عند مستويات الجزيئية، الصرفية، والوظيفية 5،10. SOX-2 ينظم بشكل مختلف تمايز محطة من AWB والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية من خلال التفاعل مع العوامل شريك النسخ التي تعتمد على السياق وخاص بهالمواقع المستهدفة الحمض النووي 5،10. SOX-2 شركاء مع LIM-4 (LHX) في محطة AWB تمايز الخلايا العصبية، في حين أن وتظهر فحوصات مراسل وسيفيراز SOX-2 شركاء مع CEH-36 (OTX / OTD) في محطة الائتلاف المناهض للحرب تمايز الخلايا العصبية التي SOX-2 و SOX-2 متحولة البروتينات G73E لها تفاعلات تعاونية مع العوامل المساعدة النسخي LIM-4 و CEH-36 لتنشيط المروج أعرب في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية. ومع ذلك، SOX-2 ومتحولة SOX-2 G73E عرض خصائص تفعيل التفاضلية من المروج. للتحقيق في الأساس الجزيئي للأنشطة الحمض النووي التفاضلية ملزمة من SOX-2 و SOX-2 G73E، أجريت fEMSAs مع هذه البروتينات والمواقع المستهدفة المحتملة.
أولا، اتخذ نهجا المعلوماتية الحيوية لتحديد الحمض النووي بيولوجيا تسلسل ملزمة داخل منطقة المروج 1 كيلوبايت المستخدمة في فحص وسيفيراز. وبما أن العديد من SOX-2 مواقع الربط المحتملة الحالية في جميع أنحاء المروج، ركزناعلى مواقع SOX-2 تنبأ ملزمة المتاخمة للالمفترض CEH-36 أو LIM-4 مواقع الربط والحفاظ تطويريا بين الأنواع الخيطية المختلفة. تم حذف هذه المتتاليات أو تحور، واختبار في وقت لاحق في الجسم الحي لنشاطهم في التعبير عن الجينات المحورة مراسل GFP في AWB أو AWC الخلايا العصبية. من خلال هذا النهج، حددنا المحتملة LIM-4 / SOX-2 و CEH-36-2 SOX المجاورة المواقع المستهدفة / المطلوبة على وجه التحديد للتعبير عن GFP في البنك الوطني المصري والائتلاف المناهض للحرب الخلايا العصبية، على التوالي 5. نحن التحقيق في الاختلافات المحتملة في الحمض النووي ملزم من SOX-2 و SOX-2 G73E باستخدام fEMSA مع تحديد LIM-4 / SOX-2 و CEH-36 / SOX-2 المواقع المستهدفة المجاورة. وأظهر تحليل EMSA في أن SOX-2 G73E لا يلزم التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 (مطلوب للتعبير الجينات في AWB) بكفاءة كما WT SOX-2 فعلت. وكان مع ذلك، SOX-2 و SOX-2 G73E لا فرق في ربط التحقيق الحمض النووي الذي يحتوي على CEH-36 / SOX-2 (أ)djacent الموقع المستهدف (مطلوب للتعبير الجينات في الائتلاف المناهض للحرب) 5،10. يحلل لنا fEMSA تقديم رؤية الميكانيكية في طبيعة G73E طفرة SOX-2 في التأثير على نشاط محدد ملزم الحمض النووي لهوية الخلية تحول النمط الظاهري AWB إلى الائتلاف المناهض للحرب. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل من fEMSA باستخدام 6xHis-SOX-2 النقاء أو 6xHis-SOX-2 G73E جنبا إلى جنب مع الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء تحقيقات الحمض النووي المسمى صبغ يحتوي على المتاخمة المواقع المستهدفة LIM-4 / SOX-2 كدراسة حالة لمعالجة سؤال البيولوجي المهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs تشكل أداة فعالة للتحقيق في التفاعلات البروتينية الحمض النووي، وتكون بديلا لوسم المشعة من الحمض النووي. والأصباغ الفلورية مثل الأصباغ الحمراء المتاحة تجاريا، وتوفير وسيلة أكثر أمانا وصديقة للبيئة مقارنة مع وضع العلامات الحمض النووي المشع. EMSAs باستخدام الأشعة تح…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
Riferimenti
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
