Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Summary

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Abstract

Ensayos de movilidad electroforética (EMSA) son una herramienta fundamental para caracterizar las interacciones entre las proteínas y sus secuencias de ADN diana. La radiactividad ha sido el método predominante de marcaje de ADN en EMSAs. Sin embargo, los recientes avances en los tintes fluorescentes y métodos de exploración han impulsado el uso de la marcación fluorescente de ADN como una alternativa a la radiactividad de las ventajas de la fácil manipulación, ahorro de tiempo, la reducción de costes, y mejorar la seguridad. Recientemente, hemos utilizado la EMSA fluorescente (FEMSA) para abordar con éxito una importante cuestión biológica. Nuestro análisis FEMSA proporciona una visión mecanicista en el efecto de una mutación sin sentido, G73E, en el factor de transcripción de la HMG SOX-2 altamente conservada en la diversificación tipo de neurona olfativa. Se encontró que el mutante SOX-2 de proteínas ^G73E altera la actividad de unión de ADN específica, lo que provoca la transformación de identidad neurona olfativa. A continuación, presentamos una optimizada y rentable paso a paso el protocoloFEMSA para el uso de oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes y purificados SOX-2 proteínas (WT y mutantes SOX-2 proteínas ^G73E) como un ejemplo biológico.

Introduction

EMSAs se utilizan para analizar las interacciones entre el ADN y las proteínas mediante el uso de poliacrilamida nativo electroforesis en gel (PAGE) para resolver una mezcla de una proteína de interés y una sonda de ADN marcado que contiene los posibles sitios diana de la proteína ^1. Una sonda de ADN vinculados con la proteína migrará más lento en comparación con una sonda de ADN libre, y por lo tanto retraso en su migración a través de una matriz de poliacrilamida. El radiomarcado de ADN por ³² P ha sido el método predominante para la detección en EMSAs. Aunque la aplicación de radiomarcaje en la investigación bioquímica ha sido beneficioso, se están empleando métodos de marcaje de ADN alternativa con sensibilidad comparable debido a los riesgos de salud y seguridad asociados con el manejo de la radiactividad. Estos métodos alternativos incluyen la conjugación de ADN con biotina ² o digoxigenina (DIG) ³ (ambos de los cuales a continuación, son detectados por los sistemas quimioluminiscentes), SYBR verde tinción de los geles página ^4,o la detección directa de los conjugados de tinte de ADN fluorescente mediante el escaneo de la ^5,6 gel.

Los geles resueltos de EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas radiactivamente requieren un procesamiento postrun a través de películas de autorradiografía o un sistema PhosphorImager para detectar señales radiactivas ^1,7. Los geles de EMSAs utilizando biotina ² o DIG conjugados sondas ³ de ADN también se deben procesar y se transfirieron a una membrana adecuada y luego detectados por quimioluminiscencia ^6. SYBR verde tinción del gel requiere tinción de gel postrun y un escáner de fluorescencia ^4. Dado que se requieren etapas de procesamiento gel postrun para EMSAs utilizando estas técnicas de marcaje de ADN, el gel resuelto se puede ensayar sólo una vez. En contraste, las sondas de ADN marcadas con fluoróforos pueden ser detectados directamente en el gel en el interior de las placas de vidrio por un escáner. Por lo tanto, las interacciones ADN-proteína se pueden monitorizar y se ensayaron varias veces a diferentes puntos de tiempo durante la ejecución, quereduce significativamente el tiempo y el costo. Los conjugados de tinte de ADN fluorescente que se han utilizado para EMSAs incluyen Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, fluoresceína ^9, y colorantes fluorescentes infrarrojos ^4-6.

Regulación transcripcional requiere interacciones proteína-ADN de factores de transcripción y sus genes diana. La coordinación de estas interacciones genera diversos tipos de células a partir de un antepasado común durante el desarrollo animal. Una pantalla de genética hacia adelante imparcial identificado una mutación de sentido erróneo, G73E, en el dominio de unión a ADN HMG altamente conservadas de la Caenorhabditis elegans factor de transcripción SOX-2. La mutación en una transformación de identidad celular de las neuronas olfativas AWB en AWC neuronas olfativas en los niveles moleculares, morfológicos y funcionales ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula la diferenciación terminal de AWB y AWC neuronas mediante la interacción con factores de transcripción dependientes del contexto socio y respectivaSitios diana de ADN ^5,10. SOX-2 se asocia con LIM-4 (LHX) en el terminal AWB diferenciación neuronal, mientras Sox-2 socios con CEH-36 (OTX / OTD) en terminal de la diferenciación neuronal AWC. Ensayos de reportero de luciferasa muestran que Sox-2 y mutantes Sox-2 ^G73E proteínas tienen interacciones cooperativas con cofactores de transcripción LIM-4 y CEH-36 para activar un promotor expresado en AWB y AWC neuronas. Sin embargo, SOX-2 y mutante SOX-2 ^G73E muestran propiedades de activación diferencial del promotor. Para investigar la base molecular de las actividades de unión de ADN diferenciales de SOX-2 y SOX-2 ^G73E, fEMSAs se realizaron con estas proteínas y sus sitios diana potenciales.

En primer lugar, se tomó un enfoque de la bioinformática para identificar las secuencias de unión dentro de la región del promotor 1 kb utilizado en el ensayo de luciferasa de ADN biológicamente relevante. Desde múltiples Sox-2 posibles sitios de unión estuvieron presentes durante todo el promotor, nos concentramosen los sitios de unión de SOX-2 predichos adyacentes a putativo CEH-36 o LIM-4 sitios de unión y evolutivamente conservadas entre diferentes especies de nematodos. Estas secuencias se eliminan o mutadas, y posteriormente se probaron in vivo para determinar su actividad para expresar transgenes reportero GFP en AWB o AWC neuronas. A través de este enfoque, hemos identificado posibles LIM-4 / SOX-2 y de la CEH-36-2 SOX sitios diana adyacentes / que se requieren específicamente para la expresión de GFP en AWB y AWC neuronas ^5, respectivamente. Se investigaron las posibles diferencias en el ADN vinculante de SOX-2 y Sox-2 ^G73E usando FEMSA con las CEH-36 / SOX-2 sitios diana adyacentes identificados LIM-4 / SOX-2 y. Nuestro análisis mostró que la EMSA SOX-2 ^G73E no se unió la sonda de ADN que contiene los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes (requeridos para la expresión de genes en AWB) tan eficientemente como WT Sox-2 lo han hecho. Sin embargo, Sox-2 y SOX-2 ^G73E no tenían ninguna diferencia en la unión de la sonda de ADN que contiene la CEH-36 / SOX-2 unasitio de destino djacent (necesario para la expresión de genes en AWC) ^5,10. Nuestra FEMSA analiza proporcionar una visión mecanicista de la naturaleza de la mutación ^G73E SOX-2 en afectar a la actividad de unión al ADN específico para la identidad de célula fenotipo de transformación AWB-a-AWC. A continuación, describimos un protocolo optimizado de FEMSA usando 6xHis-Sox-2 purificados o 6xHis-SOX-2 ^G73E junto con sondas de ADN marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes como caso de estudio para abordar una importante cuestión biológica.

Protocol

NOTA: EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescencia u otras formas de ADN marcado comparten los mismos protocolos para la proteína o preparación de extracto de células, reacción de unión proteína-DNA, y la preparación de gel de PAGE y se ejecuta (Figura 1A). Las principales diferencias son procedimientos de ADN de etiquetado, las etapas de procesamiento de gel post-estreno y los métodos de detección. 1. Preparación del gel Preparar 5% de gel de poliacrilamida nat…

Representative Results

Naranja G carga de colorante (6x: 0,12 g de Orange G en 100 ml de 30% de glicerol) se puede añadir a la reacción de unión antes de la carga para visualizar el progreso de la electroforesis. Serán detectados Otros colorantes de carga, incluyendo azul de bromofenol durante la exploración y por lo tanto interfieren con análisis de imagen (Figura 1B). En algunos casos de EMSAs, especialmente si se utiliza la…

Discussion

fEMSAs son una herramienta eficaz para investigar las interacciones proteína-ADN, y son una alternativa a la marcación radiactiva de ADN. Los tintes fluorescentes tales como tintes de infrarrojos están disponibles comercialmente, y proporcionan un método más seguro y más respetuoso del medio ambiente en comparación con marcaje de ADN radiactiva. EMSAs utilizando fluorescentes infrarrojos oligonucleótidos marcados con colorante no requieren etapas de procesamiento gel postrun, y por lo tanto ahorrar tiempo y cost…

Materials

30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides.  Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'–>5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred as a particular imaging software in the mansucript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA