MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Embryon vitrification clinique a évolué avec le développement de dispositifs de vitrification uniques dans le 21 ème siècle et avec l'idée fausse que le refroidissement ultra-rapide dans un système «ouvert» (c. -à- directe LN 2 contacts) était une nécessité d'optimiser le succès de vitrification. Le dogme entourant l'importance des taux de refroidissement a conduit à des pratiques dangereuses soumises à des variations techniques et à la création de dispositifs de vitrification qui négligées importants facteurs de contrôle qualité (par exemple, la facilité d'utilisation, la répétabilité, la fiabilité, la sécurité de l' étiquetage, de sécurité et de stockage). Comprendre les défauts de contrôle de qualité des autres appareils autorisés pour le développement d'une méthode uS-VTF sûr, sécuritaire, reproductible et fiable visant à minimiser la variation intra- et inter-technicien. Tout aussi important, il combine la disponibilité de deux dispositifs conformes FDA existants: 1) un ionomère de paille d'embryons de résine 0,3 ml avec intériorisé, deux couleurs, trifouiller-pétiquetage sur le toit avec répétable potentiel de joint de soudure; et 2) raccourcie, couramment utilisé, 300 um ID flexipettes stériles pour charger directement l'embryon (s) afin de créer un dispositif de vitrification global très efficace. Comme les autres aseptique, les systèmes fermés de vitrification (par exemple, de haute sécurité vitrification (HSV), Rapid-i, et VitriSafe) effectivement utilisés en médecine reproductive, microSecure vitrification (pS-VTF) a prouvé qu'il peut atteindre la survie et la grossesse haute post-réchauffement résultats avec son attention à la simplicité, et la variation technique réduite. Bien que la paille de l'embryon 0,3 ml contenant un bouchon hydrophobe interne a été remplacé dans le commerce avec une paille de sperme norme possédant le coton-polyvinylpyrrolidone (PVP) bouchons, il a maintenu sa composition de résine ionomère pour assurer la soudure d'étanchéité. Cependant, les bouchons de coton peuvent évacuer le contenu fluide embryon des flexipettes lors d'un contact. Une méthode uS-VTF modifié a été adapté pour inclure une soudure interne supplémentairesceller avant le bouchon sur le côté dispositif de chargement. L'étape technique ajoutée à la procédure uS-VTF n'a pas affecté son application réussie, les taux de survie aussi élevé (> 95%) et les taux de grossesse se poursuivre aujourd'hui.
La vitrification est la technologie assistée le plus d' impact unique de la reproduction dans l'industrie la fécondation in vitro (FIV) depuis le développement de l' injection intracytoplasmique de spermatozoïdes. Aujourd'hui, les blastocystes sont cryoconservés sans la perte de la viabilité des embryons précédemment associés aux méthodes classiques de congélation lente 1. Avec embryon de survie post-réchauffement fiable, l'industrie de l'infertilité se transforme en l'utilisation préférée de cryoconservés cycles de transfert d'embryons, qui donnent des résultats de grossesse similaires ou plus élevés que le transfert traditionnel d'embryons frais. En association avec blastocyste biopsie et le dépistage génétique préimplantatoire (PGS), la vitrification est devenu un outil clinique essentiel pour optimiser les résultats de naissances vivantes en bonne santé via euploïde transfert d' un seul embryon 2, 3.
Murine embryon vitrification a été développé au milieu des années 1980 4, </sup> 5 et adapté à l' agriculture animale en 1990 , 6. Partant du principe que les solutions de vitrification forment un état glasseous métastable, sans endommager la formation de cristaux de glace, il a prouvé à préserver plus efficacement l'intégrité cellulaire complète des embryons. Fait intéressant, l'acceptation prometteuse de vitrification en embryologie humaine n'a pas commencé à être réalisé jusqu'à ce que le 21 ème siècle. Les premières publications visant à promouvoir l'utilisation de vitrification a coïncidé avec le développement de dispositifs uniques «ouverts» du système 7, 8, 9. Cependant, l'adoption de vitrification dans la pratique clinique a été lente, comme il est venu à un moment où l'amélioration de la lente blastocyste congélation ont également été produisent. Le succès de congélation conventionnelle lente taux, en plus de vitrification, ont été alignées avec des améliorations dans les systèmes de culture d'embryons, ainsi qu'avec l'incorporer l'ion d'approches blastocoele-effondrement, qui a amélioré à la fois la survie globale des trophectoderme et, par la suite, l' implantation 10.
Dans la dernière décennie, la technologie de vitrification a rapidement supplanté les pratiques de congélation classiques. Dans une large mesure, cela était dû à la mise au point de dispositifs de vitrification spécialisés. Certains de ces appareils ont handicapé la sécurité, l' efficience et l' efficacité de la vitrification clinique en introduisant des défauts de conception inhérents aux dispositifs utilisés dans l'industrie de la FIV 11. En effet, les nuances des différents dispositifs introduisent une variation technique significative entre les programmes, communément appelés «signatures techniques» 12. Ainsi, des revues scientifiques, comme le Journal of Experiments Visualized (JoVE), peuvent servir comme une ressource précieuse pour démontrer les détails techniques, ce qui contribuera à réduire la variation des résultats. Un autre problème récurrent est que l'artertains embryologistes continuent d'être mal informé, aujourd'hui encore, sur la base de revendications que le "refroidissement ultra-rapide des embryons ou des ovocytes dans un« système de vitrification ouvert »(c. -à- contact embryon direct avec l' azote liquide (LN2)) est une condition préalable à l' optimisation les taux de réussite. " De toute évidence, cette croyance est inexacte, basée sur le succès éprouvé des aseptique systèmes 13, 14, 15 fermé.
Sur la base des principes cryobiologiques de vitrification, l'efficacité de vitrification est plus fortement dépendant des taux de réchauffement que sur les taux 16, 17, 18 de refroidissement. D'une manière générale, indépendamment du dispositif de vitrification utilisé, le taux de chauffage doit être supérieure à la vitesse de refroidissement afin d'assurer des taux de survie élevés. Les taux élevés de réchauffement minimisent la possibilité pour toute croissance de la glace (ie, le recrystallization d'impuretés nucléées dans cryo-solutions) pendant la phase de réchauffement de la dévitrification. Certes, la stabilité de la solution de vitrification (ie, le type et la concentration des agents cryoprotecteurs utilisés) peut avoir un effet de confusion, mais cela est abordé dans une publication distincte 11. Compte tenu des questions de taux-réchauffement refroidissement, MicroSecure vitrification (pS-VTF) a été développé en 2008 comme une méthode peu coûteuse, non-commerciale, conformes à la FDA qui optimise les aspects de contrôle de qualité de vitrification. Il était unique en ce qu'elle a offert inviolable, intériorisée, double étiquetage de couleur. En outre, en chargeant et en stockant les embryons directement dans le flexipette stérile utilisé pour le pipetage ( à savoir, sans pipetage sur une surface de dispositif secondaire) et en utilisant des pailles ionomère de résine qui scellent complètement soudé au moyen d' un scellement automatique, la variation technique a été effectivement éliminés.
Lors de l'évaluation de la completeness de dispositifs de vitrification pour une utilisation potentielle, il existe plusieurs facteurs de contrôle de qualité qui devraient être prises en compte, y compris: 1) Étiquetage étiquettes -Can potentiels être solidement respectées? Sont-ils inviolables? Ils offrent deux couleurs potentiel d'identification? Est – il besoin d' une étiquette secondaire, et peut l'étiquette facilement être enlevé à des fins de tenue de dossiers (c. -à- patients vérification) post-réchauffement? 2) la facilité technique des embryons -Peut être facilement chargés dans / sur le dispositif en temps opportun et simplement identifiés et suivis post-réchauffement? 3) simplicité procédurale / répétabilité -Est la méthode de vitrification offre la simplicité et la fiabilité qui permet facilement de répétabilité, ce qui minimise la variation entre les techniciens (internes) et les programmes (externes)? 4) la capacité de stockage LN 2 -Pouvez les dispositifs facilement et en toute sécurité manipulé et identifié? Leur storage espace potentiel efficace? Est-ce que la sécurité de l'offre de l'appareil et la sécurité contre les dommages physiques ou contaminants possibles comme un système fermé aseptique? 5) Le potentiel de rétablissement / survivabilité -Est la conception sujettes à des problèmes potentiels dans la récupération garantie d'embryons de l' appareil, et seront – ils vitrifier de manière fiable et maintenir post-réchauffement complet de l' intégrité cellulaire? Cette dernière préoccupation de qualité spécifique, le taux de récupération, a effectivement été étonnamment minimisé dans les rapports publiés; cela se fait en se cachant généralement le résultat défavorable (c. -à- embryon perdu ou œuf) dans typiquement de bons taux de survie. Tout dispositif sujettes à récupération incompatibles (<99%) est gravement viciée et constitue une responsabilité procédurale.
Notre aseptique, fermée méthode uS-VTF a été stratégiquement conçu pour tenir compte de chaque mesure de contrôle de qualité. Cependant, après 5 ans de succès clinique supérieure et de validation 14, la procédure avait to être modifié. Les pailles originales d'embryons de 0,3 mL (possédant un bouchon hydrophobe) ont été retirés de l'industrie de la FIV et remplacées par une paille de 0,3 ml de sperme possédant un bouchon de coton / PVP standard (c. -à- réétiqueté comme semence / embryon paille). Ce document décrit les étapes de la procédure et des stratégies spécifiques nécessaires pour mettre en œuvre uS-VTF en toute sécurité, tout simplement, et efficacement. En outre, nous mettons en évidence la modification (s) nécessaire pour tenir compte de manière fiable pour les limitations d'approvisionnement, jusqu'à ce que un récipient idéal de remplacement de paille est réintroduit dans le laboratoire clinique.
Aujourd'hui, il y a une forte attente d'atteindre la survie de blastocyste complète (> 95%) et la réussite d'une implantation similaire à celle d'embryons frais. Certains groupes ont suggéré que les taux de naissances vivantes de cycles de transfert d'embryons vitrifiés sont peut-être encore plus élevé que les blastocystes frais lorsque l'embryon cryoconservé intact est transplanté dans un utérus sain non hormonale stimulée. Nos données indiquent clairement que la vitrification maintient efficacement et de manière fiable la viabilité de l'embryon frais. De plus, nous avons prouvé que notre aseptique, méthode fermée, appelée MicroSecure vitrification (pS-VTF), peut obtenir un résultat optimal comparable ou supérieure aux normes commerciales (c. -à- systèmes de dispositifs ouverts) utilisés dans l'industrie de la FIV.
La variation est associée à la répétabilité et la fiabilité techniques entre les individus en utilisant une multitude de vitrification appareils / méthodes. À son tour, cela a abouti à inconsistencies entre les programmes d'application vitrification. Par conséquent, il est peu surprenant que la familiarité de l'appareil est un facteur important en ce qui concerne la compétence des laboratoires et des résultats positifs. Il est cette notion de «signature technique» 11 qui explique pourquoi la répétabilité entre les programmes peut être problématique. Non seulement le développement de plus d'une douzaine de dispositifs commerciaux compliqués ce phénomène, il a créé des préoccupations de contrôle de qualité. Heureusement, les systèmes fermés de vitrification, comme uS-VTF, Rapid-I, et VitriSafe, sont maintenant révèle être tout aussi efficace pour ouvrir les systèmes de l' appareil 12, 13, 14.
MicroSecure VTF est une nouvelle technique de vitrification aseptique développé avec aisance technique, la fiabilité et cryo-sécurité à l'esprit. En combinant l'utilisation de deux approuvés antérieurement, les dispositifs conformes FDA, il existe un système de vitrification non commercial wvec l'avantage d'avoir un faible coût établi, contrairement aux dispositifs spécialisés. En outre, son unique et infalsifiable système d'étiquetage à double couleur intériorisé, ainsi que de nombreux autres avantages de contrôle de qualité, ont fait uS-VTF une option globale attrayante 11. En tant que dispositif de VTF non-commercial, cependant, son application de l'industrie répandue évolue lentement. Seule la publication continue de sa sûreté, la sécurité et l'efficacité clinique sera un gain uS-VTF croissante utilisation.
En Août 2014, face à l'incapacité d'acquérir les 0,3 ml embryon de paille d'origine fabriqué avec un non-évacuation de bouchon intérieur, hydrophobe, nous avons pu modifier de façon fiable la méthode uS-VTF. En bref, le nouveau sperme 0,3 mL / pailles d'embryons avec leurs bouchons de coton-PVP ont effectivement été adaptés. Ceci a été obtenu simplement en créant un joint interne avant la prise de coton, empêchant ainsi le contact et le liquide de mèche avec leembout ouvert VTF (ie, le flexipette contenant l'embryon ou les œufs). En outre, si les tiges d'identification de 40 mm ne sont pas accessibles, la question de flottabilité associée avec les plus légères tiges de 30 mm peut être contrebalancé en utilisant deux roulements à billes.
Ces étapes supplémentaires ont fait la technique un peu moins simple, mais très efficace. Aujourd'hui, l'économie et l'efficacité sont de plus en plus importantes préoccupations, comme blastocystes biopsiées sont généralement vitrifiés individuellement jusqu'à ce que leur statut euploidy est confirmée sur un rapport de la génétique. Blastocystes avec un statut aneuploïdie non viable confirmé obtiennent généralement jetés, avec le consentement du patient, dans quelques semaines. Ainsi, la majorité (> 50%) des dispositifs de VTF sont rejetés après un stockage à court terme, ce qui provoque un coût annuel escalade lors de l'utilisation des dispositifs commerciaux. Dans l'ensemble, uS-VTF est une procédure très efficace, fiable et reproductible pour la cryoconservation des blastocystes humains. Le supérieur Securel de conception de contrôle de qualitéétiquettes y et en toute sécurité stocke les ovocytes / embryons, tout en éliminant l'échec de la récupération et l'optimisation de la survie et la viabilité post-réchauffement, ce qui justifie l'utilisation du système comme une approche universelle de l'embryon vitrification.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe aimerait remercier M. Forest Garner au Centre de fertilité de Las Vegas pour son expertise statistique dans l'analyse et l'évaluation des données annuelles CDC et SART. En outre, les auteurs tiennent à remercier leur directeur médical, le Dr Robert E. Anderson, pour son soutien dévoué et la foi en nos capacités techniques et de l'expertise.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |