يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر
Summary
تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.
Abstract
انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هو أداة استثنائية لدراسة التركيب الدقيق خلية، من أجل توطين البروتينات وتصور المجمعات الجزيئات في دقة عالية جدا. ومع ذلك، للحصول على أقرب ما يمكن إلى الدولة الأم، مطلوب الكمال الحفاظ على العينة. التقليدية المجهر الإلكتروني (EM) التثبيت مع الألدهيدات، على سبيل المثال، لا يوفر الحفاظ التركيبية جيد. اختراق البطيء للمثبتات يدفع إعادة تنظيم الخلايا وفقدان مكونات الخلية المختلفة. لذلك، EM تثبيت التقليدي لا يسمح لاستقرار لحظية والحفاظ على الهياكل واستضداد. أفضل خيار لدراسة الأحداث داخل الخلية هو استخدام cryofixation تليها طريقة تثبيت تجميد الاستبدال التي تحافظ على خلايا في حالتها الأصلية. الضغط العالي تجميد / تجميد الاستبدال، الذي يحافظ على سلامة التركيب الدقيق الخلوية، هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن يتطلب expensiلقد المعدات. هنا، يتم تقديم وسيلة سهلة الاستخدام والتكلفة المنخفضة للتجمد تثبيت تليها تجميد استبدال لمزارع الخلايا تعليق.
Introduction
إعداد عينة أمر بالغ الأهمية لنجاح أي دراسة المجهر الإلكتروني. كان التقليدية EM تثبيت الوسيلة الرئيسية لتحديد الأنسجة أو الخلايا للانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) 1. أولا، يتم استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم لإصلاح كيميائيا المواد في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم المجففة المواد مع المذيبات العضوية، تسلل، وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. هذا الأسلوب يعتمد على معدل تغلغل المثبتات في الخلية. وبالتالي، فإن القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلوية وعادة ما تكون لاحظت 2.
Cryofixation ومن الواضح أن البديل الأفضل للحفاظ على الهياكل الخلوية 3، وحفظ لهم سليمة. أعلى مستوى من الجودة من الصور TEM 4 في أقسام الراتنج رقيقة يمكن الحصول عليها باستخدام طريقة الاستبدال cryofixation / التجميد. والهدف من هذه التقنية هو الحصول على نصف المزججعينات ological دون تشكيل بلورات الثلج أو التي تحتوي على بلورات الثلج الصغيرة بما يكفي كي لا تلحق الضرر التركيب الدقيق للخلايا. تجميد الضغط العالي (HPF) وcryofixation فائقة سريعة، وهو ما يسمى أيضا يغرق التجمد (PF)، طريقتان لcryofix العينات. HPF يشل الجزيئات في خلية على الفور والابتعاد عن الأضرار الناجمة عن تثبيت EM التقليدية. وقد تم تطوير عدة أنواع من آلات تجميد والأجهزة الاستبدال التلقائي 5. آلات التجميد والمواد الاستهلاكية (النيتروجين السائل، عينة الناقلين، الخ) غالية الثمن، لكنها تسمح لإنتاج الميكروسكوب الإلكتروني ذات جودة عالية 6، 7. PF هو الاسلوب الذي تم استخدامه في أوائل 1950s، ويوصف في الأدبيات بسيطة ورخيصة 8. وخلال إجراء PF، يتم تجميد العينة مستعدة بمعدل سريع للحصول على بلورات الثلج حجم أقل من 3 إلى 5 نانومتر. تحقيقا لهذه الغاية، والعينةسقطت في كريوجين السائل، مثل الإيثان والبروبان، أو خليط الإيثان والبروبان. منذ 1950s، وقد تم القيام به تحسينات PF لجعل هذه التقنية متاحة لعدد أكبر من المستخدمين. ارتفاع ضغط التجميد هو حاليا السبيل الوحيد لتجميد مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج سمكا من 50 ميكرون (تصل إلى سمك 200 ميكرون لعينات على شكل قرص) 5، في حين يستخدم PF على نطاق واسع لصورة الأشياء الصغيرة (<100 نانومتر )، مثل المجمعات الجزيئات العالقة في طبقة رقيقة من الجليد غير متبلور 9. عينات أكبر، على سبيل المثال خلايا حقيقية النواة، يمكن cryofixed التي كتبها PF، ولكنها تتطلب عينة أصحاب، مثل الأنابيب الشعرية النحاس أو أنظمة ساندويتش 8 و 10 و 11.
هنا، وسريعة وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة يغرق التكنولوجيا تجميد / تجميد الاستبدال التي يمكن استخدامها لمختلف الثقافات تعليق خلية يرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تيم هو وسيلة قوية لمراقبة التركيبية لعضيات الخلايا والأنسجة. Cryofixation / تجميد الاستبدال هو حاليا أفضل طريقة للحفاظ على حد سواء التركيب الدقيق والبروتين استضداد. المثبتات الكيميائية تخترق وتعمل ببطء شديد مما يتيح إعادة ترتيب الهيكلية قبل أن يتم تثبيت كاملة من التركيب ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعرب عن امتناننا لM. Bouchecareilh، E. Tétaud، S. Duvezin-Caubet، وA. ديفين لما قدموه من مساعدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن ممتنون إلى القطب التصوير الالكتروني للمركز التصوير بوردو حيث تم التقاط الصور. وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
