Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie
Summary
Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.
Abstract
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein außergewöhnliches Werkzeug für die Ultrastruktur der Zelle zu studieren, um die Proteine zu lokalisieren und makromolekularen Komplexe mit sehr hohen Auflösung sichtbar zu machen. Doch so nah wie möglich an den nativen Zustand, perfekte Probenkonservierung zu bekommen ist nicht erforderlich. Herkömmliche Elektronenmikroskopie (EM) Fixierung mit Aldehyden, zum Beispiel, bietet keine gute ultra Erhaltung. Die langsame Eindringen von Fixateure induziert Zell-Reorganisation und Verlust verschiedener Zellkomponenten. Daher tritt herkömmliche EM Fixierung nicht für eine sofortige Stabilisierung und Konservierung von Strukturen und Antigenität ermöglichen. Die beste Wahl intrazelluläre Ereignisse für die Prüfung ist Kryofixation durch das Verfahren gefrier Substitution Fixierung gefolgt zu verwenden, die Zellen in ihrem nativen Zustand hält. Hochdruck-Gefrier / Gefriersubstitution, die die Integrität der zellulären Ultrastruktur bewahrt, ist die am häufigsten verwendete Methode, erfordert aber expensive Ausrüstung. Hier eine einfach zu bedienende und kostengünstige Gefriertfixationsmethode gefolgt von Gefriersubstitution für Suspensionszellkulturen vorgestellt.
Introduction
Die Probenvorbereitung ist für den Erfolg eines jeden Elektronenmikroskopie Studie kritisch. Herkömmliche EM Fixierung war die primäre Methode für Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 1 fixiert. Erstens, Aldehyde und Osmiumtetroxid verwendet werden, um chemisch das Material bei Raumtemperatur fest. Dann wird das Material mit organischen Lösemitteln dehydratisiert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Dieses Verfahren ist auf die Penetrationsrate von Fixierungsmittel in die Zelle abhängig. Folglich werden die Artefakte und Extraktion von Zellinhalt in der Regel 2 beobachtet.
Kryofixation ist eindeutig eine bessere Alternative für die Erhaltung der Zellstrukturen 3, sie intakt zu halten. Die höchste Qualität der TEM – Aufnahmen 4 in dünnen Harzabschnitte können mit Hilfe der Kryofixation / Gefriersubstitution Verfahren erhalten werden. Das Ziel dieser Technik ist verglast bi zu erhaltengischen Proben ohne Eiskristalle Bildung oder Eiskristalle enthalten klein genug, um nicht die Ultrastruktur der Zellen zu beschädigen. Hochdruck-Gefrieren (HPF) und ultra-schnelle Kryofixation, die auch plunge Gefrieren (PF) genannt wird, sind zwei Methoden Proben cryofix. HPF bewegungsunfähig Moleküle in der Zelle augenblicklich und vermeidet die durch herkömmliche EM Fixierung verursacht wird. Verschiedene Arten von Gefriermaschinen und automatische Substitution Geräte wurden 5 entwickelt. Die Gefriermaschinen und Verbrauchsmaterialien (flüssiger Stickstoff, Probenträger, etc.) sind teuer, aber sie ermöglichen die Herstellung qualitativ hochwertige elektronenmikroskopische Aufnahmen 6, 7. PF ist eine Technik , die in den frühen 1950er Jahren verwendet wurde und wird in der Literatur als einfach und billig 8 .Während die PF Verfahren, die vorbereitete Probe mit einer schnellen Rate eingefroren wird beschrieben Eiskristalle Größe von weniger als 3 bis 5 nm zu erhalten. Zu diesem Zweck wird die ProbeIn ein flüssiges Kryogen, wie Ethan, Propan oder ein Ethan-Propan-Gemisch eingetaucht. Seit den 1950er Jahren wurden Verbesserungen von PF durchgeführt, um diese Technik einer größeren Anzahl von Benutzern zur Verfügung zu stellen. Hochdruckgefrieren ist derzeit der einzige lebensfähige Weg, um eine große Vielfalt von Proben dicker als 50 μm (bis zu einer Dicke von 200 μm für scheibenförmige Proben) 5 , während PF weit verbreitet ist, um kleine Objekte (<100 nm ), Wie makromolekulare Komplexe, die in einem dünnen Film aus amorphem Eis 9 suspendiert sind. Größere Proben, beispielsweise eukaryotische Zellen, können durch PF kryofixiert werden, benötigen aber Probenhalter, wie Kapillarkupferrohre oder Sandwich-Systeme 8 , 10 , 11 .
Hier wird eine schnelle, einfach zu bedienende und kostengünstige Einfrier- / Gefrier-Substitutionstechnologie vorgestellt, die für verschiedene Suspensionszellkulturen verwendbar ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM ist eine leistungsfähige Methode für die ultrastrukturelle Beobachtung von Organellen, Zellen und Geweben. Kryofixierung / Gefrier-Substitution ist derzeit die beste Methode zur Erhaltung der Ultrastruktur- und Protein-Antigenität. Chemische Fixiermittel durchdringen und wirken sehr langsam, wodurch strukturelle Umlagerungen vor der vollständigen Stabilisierung der Ultrastruktur 2 möglich sind . Umgekehrt stabilisiert die Kryofixierung / Gefrier-Substitution sofort die Zellstrukturen <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet und A. Devin für ihre Hilfe und Kommentare zum Manuskript. Wir sind dankbar, dass die elektronische Abbildungs Pol Bordeaux Imaging Center, wo die Bilder aufgenommen wurden. Diese Arbeit wurde von Centre National de la Recherche Scientifique unterstützt.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
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