מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.
Abstract
הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) הוא כלי יוצא דופן לחקר ultrastructure תא, כדי למקם חלבונים ולדמיין מתחמי macromolecular ברזולוציה גבוהה מאוד. עם זאת, כדי להתקרב ככל האפשר אל למצב הטבעי, שימור מדגם מושלם נדרש. קיבוע במיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי (EM) עם אלדהידים, למשל, אינו מספק שימור ultrastructural טוב. החדירה האיטית של fixatives גורמת ארגון מחדש תאים ואובדן מרכיבי תא שונים. לכן, קיבוע EM קונבנציונאלי אינו מאפשר התייצבות מיידית ושימור מבנים antigenicity. הבחירה הטובה ביותר לבחינת אירועים תאיים היא להשתמש cryofixation ואחריו שיטת קיבוע הקפאה-ההחלפה שמחזיקה תאים במצב הטבעי שלהם. בלחץ גבוה הקפאה / להקפיא-החלפה, השומרת על שלמות ultrastructure הסלולר, היא השיטה הנפוצה ביותר, אך דורשת expensive ציוד. הנה, שיטת קיבוע הקפאה קלה לשימוש וזול ואחריו-החלפת הקפאה עבור תרביות תאי השעיה מוצגת.
Introduction
לדוגמא ההכנה היא קריטית להצלחה של כל מחקר במיקרוסקופ אלקטרונים. קיבוע קונבנציונלי EM היה השיטה העיקרית לתיקון רקמות או תאים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) 1. ראשית, אלדהידים ו tetroxide אוסמיום משמשים כדי לתקן את חומר כימי בטמפרטורת החדר. ואז, החומר הוא מיובש עם ממיסים אורגניים, חדרו, ומוטבעים שרף אפוקסי. שיטה זו תלויה בשיעור החדירה של fixatives לתוך התא. כתוצאה מכך, הממצאים והפקת תכני הסלולר בדרך כלל הם נצפו 2.
Cryofixation הוא בבירור אלטרנטיבה טובה יותר לשימור מבנים הסלולר 3, להשאיר אותן ללא פגע. האיכות הגבוהה ביותר של תמונות TEM 4 בסעיפי שרף דקים ניתן להשיג באמצעות שיטת החלפת cryofixation / ההקפאה. מטרת טכניקה זו היא להשיג דו מזוגגתדגימות ological ללא היווצרות גבישי קרח או גבישי קרח המכילים קטנים מספיק כדי לא לפגוע ultrastructure של התאים. בלחץ גבוה הקפאה (HPF) ו cryofixation אולטרה-מהירה, אשר נקרא גם לצלול מקפיא (PF), הן שתי שיטות cryofix דגימות. HPF שמגביל מולקולות בתא מיידי ונמנע את הנזק שנגרם על ידי קיבוע EM קונבנציונאלי. ישנם מספר סוגים של מכונות הקפאה והתקני החלפה אוטומטיות פותחו 5. מכונות ההקפאה ומתכלה (החנקן נוזלי, דגימת ספקים, וכו ') הם יקרים, אבל הם מאפשרים הפקת micrographs אלקטרונים איכותי 6, 7. PF היא טכניקה ששימשה בשנת 1950 המוקדמות והוא מתואר בספרות פשוטה וזולה 8 .During ההליך PF, המדגם מוכן קפוא בקצב מהיר כדי להשיג גבישי קרח במידות פחות מ 3 עד 5 ננומטר. לשם כך, המדגם הואצלל לתוך קריוגן נוזלי, כגון אתאן, פרופאן, או תערובת אתנית- propane. מאז 1950, שיפורים של PF נעשו כדי להפוך את הטכניקה הזו זמינה למספר גדול יותר של משתמשים. הקפאה בלחץ גבוה היא כרגע הדרך קיימא רק להקפיא מגוון רחב של דגימות עבה יותר מ 50 מיקרומטר (עד עובי של 200 מיקרומטר עבור דגימות בצורת דיסק) 5 , ואילו PF נעשה שימוש נרחב על התמונה אובייקטים קטנים (<100 ננומטר ), כגון קומפלקסים macromolecular מושעה בסרט דק של קרח אמורפי 9 . דגימות גדולות יותר, למשל תאים אוקריוטים, יכולים להיות cryofixed על ידי PF, אבל דורש מחזיקי הדגימה, כגון צינורות נחושת נימי או מערכות כריך 8 , 10 , 11 .
הנה, מהיר לשימוש, קל לשימוש ו עלות נמוכה לצלול להקפיא / להקפיא, תחליף הטכנולוגיה שמיש עבור תרבויות תאים ההשעיה שונים מוצג.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM היא שיטה רבת עוצמה עבור תצפית ultrastructural של אברונים, תאים, רקמות. Cryofixation / הקפאה-החלפה היא כיום השיטה הטובה ביותר לשימור הוא antigenicity ultrastructure והחלבון. Fixatives הכימי לחדור ולפעול ובכך לאפשר שחלופים מבניים מאוד לאט לפני ההתייצבות המלאה של ultrastructure 2. לעומת זאת, cryo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודתנו ל M. Bouchecareilh, E. Tétaud, ס Duvezin-Caubet, וא דווין לעזרה והערות שלהם על כתב היד. אנו מודים קוטב ההדמיה האלקטרוני של מרכז דימות בורדו איפה התמונות צולמו. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
