Questo manoscritto descrive un metodo facile da usare e cryofixation basso costo per la visualizzazione cellule in sospensione mediante microscopia elettronica a trasmissione.
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Articolo metodologico
Plunge congelamento: uno strumento per l'ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è uno straordinario strumento per studiare ultrastruttura delle cellule, al fine di localizzare le proteine e visualizzare complessi macromolecolari ad altissima risoluzione. Tuttavia, per ottenere il più vicino possibile allo stato nativo, è necessaria la conservazione del campione perfetto. Convenzionale microscopia elettronica (EM) fissazione con aldeidi, per esempio, non fornisce una buona conservazione ultrastrutturali. La lenta penetrazione di fissativi induce riorganizzazione cellulare e la perdita di vari componenti cellulari. Pertanto, convenzionale fissazione EM non consente una stabilizzazione istantanea e preservare le strutture e antigenicità. La scelta migliore per l'esame di eventi intracellulari è utilizzare cryofixation seguito dal metodo di fissaggio freeze-sostituzione che mantiene le cellule nel loro stato nativo. Alta pressione congelamento / freeze-sostituzione, che preserva l'integrità della ultrastruttura cellulare, è il metodo più comunemente utilizzato, ma richiede expensive attrezzature. Qui, un metodo facile da usare ed economici freeze fissazione seguita da congelamento-sostituzione per colture cellulari La sospensione viene presentato.
Introduzione
La preparazione del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi studio di microscopia elettronica. Convenzionale fissazione EM era il metodo primario per fissare tessuti o cellule per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 1. In primo luogo, aldeidi e osmio tetrossido sono utilizzati per fissare chimicamente il materiale a temperatura ambiente. Poi, il materiale viene disidratato con solventi organici, infiltrato, e incorporata in resina epossidica. Questo metodo dipende dal tasso di penetrazione del fissativi nella cellula. Di conseguenza, i manufatti ed estrazione dei contenuti cellulari sono generalmente osservati
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Protocollo
1. Preparazione di Formvar griglia Film
NOTA: Eseguire manipolazione cloroformio sotto una cappa utilizzando dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, occhiali). Utilizzare 400 mesh griglie di rame di microscopia elettronica. Con altri tipi di rete (in altre dimensioni delle maglie, oro e griglie di nichel), la qualità di congelamento è peggio.
- Preparare una soluzione di 100 mL di 0,3% formvar in cloroformio. Permettono di sciogliere durante la notte senza agitazione.
- Mettere 400 mesh (numero di fori per pollice quadrato) griglie microscopycopper elettroni (diametro 3,05 mm) in una fiala di vetro (altezza....
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Risultati
In questo articolo, un metodo di congelamento facile da usare e tuffo basso costo per ultrastrutturali (figure 1 e Figura 2) e studi immunomarcatura (Figura 3) è presentato. Abbiamo dimostrato che non è necessario disporre di attrezzature speciali per la procedura di congelamento-sostituzione e che la procedura di riscaldamento richiede meno di 6 ore invece di 24 ore utilizzando un sistema dedicato........
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Discussione
TEM è un metodo efficace per l'osservazione ultrastrutturale di organelli, cellule e tessuti. Cryofixation / freeze-sostituzione è attualmente il metodo migliore per la conservazione di entrambi ultrastruttura e proteine antigenicità. Fissativi chimici penetrano e si comportano molto lentamente consentendo in tal modo riarrangiamenti strutturali prima della completa stabilizzazione della ultrastruttura 2. Al contrario, cryofixation / freeze-sostituzione stabilizza immediatamente strutture c.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Esprimiamo la nostra gratitudine a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin per il loro aiuto e commenti sul manoscritto. Siamo grati al polo di imaging elettronico di Bordeaux Imaging Center, dove sono state scattate le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Griglie Scienze della | microscopia elettronica | T400-Cu | |
| Formvar | Scienze della microscopia elettronica | 15800 | |
| Propano N35 | |||
| Azoto | |||
| Ago da dissezione a doppio bordo | Scienze della microscopia elettronica | 72947 | |
| crioviale | 61802-02 | ||
| Tetrossido di osmio | Microscopia elettronica | Scienze 19130 | |
| Fiala di vetro 8,5 mL | Microscopia elettronica Scienze | 64252 | |
| Acetato di uranile | Microscopia elettronica Scienze | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Etanolo 100% | Sigma | 32221 | |
| Vetro diapositive | VWR international | 631-9439 | |
| Pinzette | |||
| Resina acrilica | Microscopia elettronica | Scienze 104371 | |
| Resina epossidica M | Sigma | 10951 | |
| Resina epossidica M indurente | Sigma | 10953 | |
| Dibutilftalato | Sigma | 80102 | |
| Resina epossidica M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Tazze | fai da te negozio o fatto da solo | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Scatola ermetica | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| respiratore purificatore d'aria | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartuccia per respiratore | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Filtro antiparticolato | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixatio....
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Ristampe e permessi
