플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 라이 제이션 연구를위한 도구
Summary
이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.
Abstract
투과 전자 현미경 (TEM)은 단백질을 지역화하고 매우 높은 해상도에서 거대 분자 복합체를 시각화하기 위해 세포 미세 구조 연구를위한 특별한 도구입니다. 그러나, 기본 상태로 최대한 가까이 얻을, 완벽한 샘플 보존이 필요합니다. 알데히드와 기존의 전자 현미경 (EM) 고정은, 예를 들어, 좋은 미세 보존을 제공하지 않습니다. 고정 제의 느린 침투 세포 조직 개편 및 다양한 세포 구성 요소의 손실을 유도한다. 따라서, 종래의 고정은 EM 구조 및 항원의 순간 안정성 및 보존을 허용하지 않는다. 세포 내 이벤트를 검사하기위한 최선의 선택은 그 나라의 상태로 세포를 유지 동결 대체 고정 방법 다음 cryofixation을 사용하는 것입니다. 고압 냉동 세포 미세 구조의 무결성을 보존 / 동결 대체, 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 expensi이 필요장비를했습니다. 여기서, 현탁 세포 배양을위한 동결 교체 다음에 사용하기 쉽고 저렴한 동결 고정 방법이 제공된다.
Introduction
샘플 준비는 전자 현미경 연구의 성공을 위해 중요하다. 종래 EM 고정은 투과형 전자 현미경 (TEM) 1 조직 또는 세포를 고정하기위한 주요 방법이다. 먼저, 알데히드 및 산화 오스뮴 화학적 실온에서 재료를 고정하기 위해 사용된다. 그 후, 재료는 유기 용매 탈수 함침 한 에폭시 수지에 포함된다. 이 방법은 셀에 고정 제의 침투 속도에 의존한다. 따라서, 세포 내용물의 생성물 추출은 일반적으로 2가 관찰된다.
Cryofixation 명확 세포 구조 3의 보존을위한 더 나은 대안 그대로를 유지하고있다. 얇은 수지 부분의 TEM 이미지 (4)의 높은 품질은 cryofixation / 동결 대체 방법을 사용하여 얻을 수있다. 이 기술의 목적은 유리화 BI를 얻는 것입니다얼음 결정 형성 또는 세포의 미세 구조가 손상되지 않도록 충분히 작은 포함 된 얼음 결정이없는 론적 샘플. 고압 동결 (HPF) 또한 (PF)을 동결 런지라고 매우 빠른 cryofixation는 샘플 cryofix 두 가지 방법이다. HPF 순간적 셀 분자를 고정화 종래 EM 고정에 의한 피해를 방지한다. 냉동 기계 및 자동 대체 장치의 몇 가지 유형의 5 개발되었다. 냉동 시스템 및 소모품 (액체 질소, 등 캐리어 표본) 비싸지 만 고품질의 전자 현미경 (6, 7)를 제조 할 수 있습니다. PF는 1950 년대에 사용되었으며 간단하고 PF 절차 .During 8 싸고 준비된 샘플을 얼음 결정 미만 3 내지 5 nm의 크기를 획득하기 위해 빠른 속도로 동결 같은 문헌에 기재되어있는 기술이다. 이를 위해, 샘플입니다에탄, 프로판, 에탄 또는 프로판 혼합물과 같은 액체 냉각제로 하락. 1950 년대 이후, PF의 개선은 더 많은 수의 사용자에이 기술을 사용할 수 있도록하기 위해 수행되었다. PF 넓게 (화상 작은 물체에 사용되는 반면, 고압 동결 현재 두꺼운 50㎛보다 5 (디스크 형 샘플은 200 ㎛의 두께까지) 샘플들의 큰 다양성을 고정 할 수있는 유일한 실용적인 방법이다 <100 nm의 ), 비결정질 얼음 9의 박막에 현탁 고분자 복합체 등. 큰 샘플은 진핵 세포, 예를 들면, PF로 cryofixed하지만 모세관 구리 관 또는 샌드위치 시스템 8, 10, 11 등의 시험편 홀더를 필요로 할 수있다.
여기에, 빠른, 사용하기 쉬운 다양한 서스펜션 세포 배양에 사용 가능한 저가의 급락 동결 / 동결 대체 기술이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM은 소기관, 세포 및 조직의 미세 구조의 관찰을위한 강력한 방법이다. Cryofixation / 동결 대체는 현재 모두 미세 구조 및 단백질 항원의 보존을위한 최선의 방법입니다. 화학 고정 제를 침투 및 미세 구조 (2)의 전체 구조 안정화되기 전에 재 배열을 가능하게함으로써 매우 천천히 작동한다. 반대로, cryofixation / 동결 대체 즉시 세포 구조 (4)를 안정화시킨다. 그러…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 그들의 도움과 의견을 M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, 그리고 A. 데빈에 대한 우리의 감사를 표현한다. 우리는 이미지가 촬영 한 보르도 이미징 센터의 전자 영상 극에 감사하고 있습니다. 이 작품은 센터 국립 드 라 공들인 과학원에 의해 지원되었다.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
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