Plunge Frysing: Et verktøy for Ultra og Immunolocalization Studier av suspensjonsceller i transmisjonselektronmikroskopi
Summary
Dette manuskriptet beskriver en lett-å-bruke og rimelig cryofixation metode for visualisering av suspensjonsceller av transmisjonselektronmikroskopi.
Abstract
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) er en ekstraordinær verktøy for å studere celle ultrastrukturen, for å lokalisere proteiner og visualisere makromolekylære komplekser med meget høy oppløsning. Men for å komme så nær som mulig til den opprinnelige tilstand, perfekt prøve bevaring nødvendig. Konvensjonell elektronmikroskopi (EM) fiksering med aldehyder, for eksempel, gir ikke god ultra konservering. Den langsomme gjennomtrengning av bindemiddel induserer celle reorganisering og tap av forskjellige cellekomponenter. Derfor vil konvensjonell EM fiksering ikke tillater en umiddelbar stabilisering og konservering av strukturer og antigenisitet. Det beste valget for behandlingen av intracellulære hendelser er å bruke cryofixation etterfulgt av frysesubstitusjonsfikseringsmetode som holder cellene i deres native tilstand. Høytrykks frysing / fryse-substitusjon, noe som bevarer integriteten av cellulær ultrastrukturen, er den mest brukte metoden, men krever expensive utstyr. Her blir en lett-å-bruke og rimelig frysefikseringsmetode fulgt av fryse-substitusjon for suspensjon cellekulturer presentert.
Introduction
Prøvepreparering er avgjørende for suksess for et hvilket som helst elektronmikroskopi studien. Konvensjonelle EM fiksering var den primære metode for fiksering av vev eller celler for transmisjons-elektronmikroskopi (TEM) 1. Først blir aldehyder og osmium-tetroksyd som brukes for kjemisk å feste materialet ved romtemperatur. Deretter blir materialet dehydrert med organiske oppløsningsmidler, infiltrert og innstøpt i epoksyharpiks. Denne metode er avhengig av inntrengningshastigheten for bindemiddel inn i cellen. Følgelig blir gjenstander og utvinning av celleinnholdet som vanligvis observeres 2.
Cryofixation er helt klart et bedre alternativ for konservering av cellulære strukturer 3, holde dem intakt. Den høyeste kvalitet av TEM-bilder 4 i tynne harpiks seksjoner kan oppnås ved bruk av cryofixation / fryse-substitusjonsmetoder. Hensikten med denne teknikk er å oppnå forglasset biological samplene uten iskrystaller dannes eller som inneholder iskrystaller som er små nok til ikke å skade den ultrastrukturen av cellene. Høytrykks frysing (HPF) og ultra-hurtig cryofixation, som også kalles stupe frysing (PF), er to fremgangsmåter for å cryofix prøver. HPF immobiliserer molekyler i cellen umiddelbart og unngår skader forårsaket av konvensjonell EM fiksering. Flere typer av frysing maskiner og automatiske substitusjonsinnretninger er blitt utviklet 5. Fryse maskiner og materialer (flytende nitrogen, prøven bærere, etc.) er kostbare, men de gir mulighet for produksjon av høykvalitets-elektronmikros 6, 7. PF er en teknikk som ble brukt i de tidlige 1950-tallet og er omtalt i litteraturen så enkel og billig 8 .During PF prosedyre, blir den preparerte prøven frosset ved en hurtig hastighet for å oppnå iskrystaller størrelse mindre enn 3 til 5 nm. For å oppnå dette, er utvalgetkastet ut i et flytende kryogen, så som etan, propan, eller et etan-propan-blanding. Siden 1950-tallet har forbedringer av PF blitt gjort for å gjøre denne teknikken tilgjengelig for et større antall brukere. Høytrykks frysing er for tiden den eneste mulige måten å fryse en stor rekke prøver tykkere enn 50 um (opp til en tykkelse på 200 pm for skiveformede prøver) 5, mens PF er mye brukt til bilde små gjenstander (<100 nm ), slik som makromolekylære komplekser suspendert i en tynn film av amorft is 9. Større prøver, for eksempel eukaryote celler, kan cryofixed av PF, men krever prøveholdere, slik som kapillar kobberrør eller sandwich-systemer 8, 10, 11.
Her, en rask, lett å bruke og rimelig stupe frysing / fryse-substitusjon teknologi som kan anvendes for forskjellige suspensjon cellekulturer er presentert.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM er en kraftig metode for ultra observasjon av organeller, celler og vev. Cryofixation / fryse-substitusjonen er i dag den beste metode for bevaring av både ultrastruktur og protein antigenisitet. Kjemiske fiksativer penetrere og virke meget sakte og derved tillate strukturelle rearrangementer før den fullstendige stabilisering av ultra 2. Omvendt, cryofixation / fryse-substitusjon vendte stabiliserer cellestrukturer 4. Imidlertid cryofixation / fryse-substitusjons te…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrykker vår takknemlighet til M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet og A. Devin for deres hjelp og kommentarer til manuskriptet. Vi er takknemlige for den elektroniske billedkolonnen i Bordeaux Imaging Center hvor bildene ble tatt. Dette arbeidet ble støttet av Center National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
