Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии
Summary
Эта рукопись описывает простой в использовании и недорогой метод cryofixation для визуализации клеток суспензии с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является экстраординарным инструментом для изучения ультраструктуры клеток, для того, чтобы локализовать белки и визуализации макромолекулярных комплексов с очень высоким разрешением. Однако, чтобы получить как можно ближе к родному государству, требуется совершенное сохранение образца. Обычная электронная микроскопия (ЭМ) фиксация с альдегидами, например, не обеспечивает хорошую сохранность ультраструктурной. Медленное проникновение фиксаторов вызывает реорганизацию клеток и потерю различных клеточных компонентов. Таким образом, обычные ЭМ фиксация не позволяет мгновенной стабилизации и сохранения структур и антигенности. Лучший выбор для изучения внутриклеточных событий является использование cryofixation с последующим методом фиксации сублимационной замещения, который держит клетки в нативном состоянии. Замораживание под высоким давлением / вымораживание замещение, которое сохраняет целостность клеточных ультраструктур, является наиболее часто используемым методом, но требует expensiве оборудования. Здесь, простой в использовании и недорогой способ фиксации замораживание с последующим вымораживанием замещения для суспензии культур клеток представлена.
Introduction
Подготовка образцов имеет решающее значение для успеха любого электронной микроскопии исследования. Обычные фиксации ЭМ был основным методом для фиксации ткани или клеток для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 1. Во-первых, альдегиды и четырехокись осмия используют химически фиксировать материал при комнатной температуре. Затем материал обезвоживает с помощью органических растворителей, инфильтрации и заливал в эпоксидной смоле. Этот метод зависит от скорости проникновения фиксаторов в клетку. Следовательно, артефакты и добыча клеточного содержимого, как правило , наблюдаются 2.
Cryofixation явно лучшая альтернатива для сохранения клеточных структур 3, сохраняя их нетронутыми. Высокое качество изображений ПЭХ 4 в тонких срезах смол может быть получено с использованием методы замещения cryofixation / замерзания. Цель этого метода состоит в получении остеклованного битодические образцы без образования кристаллов льда или содержащих кристаллы льда, достаточно маленьких, чтобы не повредить ультраструктуры клеток. Замораживание высокого давления (ФВЧ) и сверхбыстрый cryofixation, который также называют врезанием замораживанием (PF), два метода cryofix образцов. ФВЧ удерживающую молекулы в клетке мгновенно и позволяет избежать повреждений, вызванных обычной фиксации EM. Несколько типов морозильных машин и устройств автоматического замещения были разработаны 5. Замораживание машины и расходные материалы (жидкий азот, образец носители и т.д.) являются дорогостоящими, но они позволяют производить высококачественные электронные микрофотографии 6, 7. ПФ представляет собой метод , который был использован в начале 1950 – х годов и описан в литературе , как простые и дешевые 8 .Во процедуру PF, приготовленный образец замораживали при быстром темпе , чтобы получить кристаллы льда размером менее 3 до 5 нм. С этой целью, образецпогрузился в жидкий криогенный, таких как этан, пропан, этан или пропан-смеси. С 1950-х годов, улучшения PF было сделано, чтобы сделать этот метод доступным для большего числа пользователей. Замораживание под высоким давлением , в настоящее время является единственным реальным способом заморозить большое разнообразие образцов толщины более 50 мкм (до толщины 200 мкм для дискообразных образцов) 5, в то время как ПФ широко используется для изображений малых объектов (<100 нм ), такой как макромолекулярные комплексы , взвешенных в виде тонкой пленки аморфного льда 9. Более крупные образцы, например , эукариотических клетках, может быть cryofixed ОФ, но требует держатели для образцов, таких как капиллярное медных трубок или систем сэндвич – 8, 10, 11.
Здесь, быстрый, простой в использовании и низкой стоимости погружной технологии замораживания / сублимационной замены используемой для различных культур клеток суспензии представлена.
Protocol
Representative Results
Discussion
ТЭМ является мощным методом для ультраструктурного наблюдения органелл, клеток и тканей. Криофиксация / замещение замораживания в настоящее время является лучшим методом для сохранения как ультраструктуры, так и белковой антигенности. Химические фиксаторы проникают и действуют очен…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем благодарность М. Bouchecareilh, Е. Tétaud, С. Duvezin-Caubet и А. Девин за их помощь и замечания по рукописи. Мы благодарны электронной полюсу визуализации бордосской изображений центра, где были сняты изображения. Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
