Måling nitrit og nitrat, metabolitter i Nitrogenoxid Pathway, i biologisk materiale ved hjælp af Chemiluminescence Method
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
Nitrogenoxid (NO) er en af de vigtigste regulator molekyler i vaskulær homeostase og også en neurotransmitter. Enzymatisk produceret NO oxideres til nitrit og nitrat ved interaktion med forskellige oxy-hæm proteiner og andre stadig ikke kendte veje. Den omvendte proces, reduktion af nitrit og nitrat til NO var blevet opdaget i pattedyr i det sidste årti, og det er ved at vinde opmærksomhed som en af de mulige veje til enten at forebygge eller lindre en lang række kardiovaskulære, metaboliske og muskelsygdomme, der menes at være forbundet med reducerede niveauer af NO. Det er derfor vigtigt at vurdere mængden af NO og dets metabolitter i forskellige organ rum – blod, kropsvæsker og de forskellige væv. Blod, på grund af sin let tilgængelighed, er det foretrukne rum, der anvendes til estimering af NO metabolitter. På grund af sin korte levetid (få millisekunder) og lav koncentration sub-nanomolær, direkte pålidelige målinger af blod NO <em> in vivo nuværende store tekniske vanskeligheder. INGEN tilgængelighed er således normalt estimeret baseret på mængden af dets oxidationsprodukter, nitrit og nitrat. Disse to metabolitter altid måles separat. Der er flere veletablerede metoder til at bestemme deres koncentrationer i biologiske væsker og væv. Her præsenterer vi en protokol for kemiluminescensmetode (CL), baseret på spektrofotometriske påvisning af NO efter nitrit eller nitrat reduktion af tri-iodid eller vanadium (III) chlorid løsninger, hhv. Følsomheden for nitrit og nitrat opdagelse er i lav nanomolær rækkevidde, der sætter CL som den mest følsomme metode øjeblikket er til rådighed til at bestemme ændringer i NO metaboliske veje. Vi forklarer i detaljer, hvordan at forberede prøver fra biologiske væsker og væv med henblik på at bevare de originale mængder af nitrit og nitrat til stede på tidspunktet for indsamlingen, og hvordan at bestemme deres respektive mængder i prøver. Begrænsninger af CL-teknik er også explained.
Introduction
Nitrit, og til en mindre udvide nitrat, niveauer i blodet afspejler overordnede tilstand af kroppens NO stofskifte. Nitrit-koncentrationer i blod og de fleste organer og væv er kun i høje nanomolære eller lav mikromolære område, nitrat er sædvanligvis til stede i meget højere mængder – i mikromolære område. Ændringer i nitrit niveauer på grund af sygdomsprogression eller ændrede kostvaner er helt små og kan kun måles ved hjælp af en meget følsom metode. På grund af deres meget forskellige niveauer og forskellige metaboliske processer, separat bestemmelse af nitrit og nitrat niveauer er afgørende. Såkaldte "NOx beslutsomhed", hvor nitrit og nitrat måles sammen har meget lidt værdi.
Der er udviklet adskillige fremgangsmåder til kvantificering nitrit i forskellige biologiske prøver – de mest almindelige er den ældste, baseret på Griess reaktion, som oprindeligt var blevet beskrevet i 1879. Selv med moderne modifications, følsomheden grænse for nitrit opnåelige ved Griess-metoden er i lav mikromolære område. Kemiluminescens (CL), kombineret med tri-iodid reducerende opløsning, betragtes i øjeblikket som den mest følsomme metode, tillader kvantificering i det lave nanomolære område af nitrit-koncentrationer 1-8,10,11. Den samme CL metode, kombineret med vanadium (III) chlorid reducerende opløsning, kan anvendes til følsomme målinger af nitrat, med præcision i det nanomolære område 9.
CL registrerer fri gas NO. Derfor nitrit, nitrat, R-nitrosothioler (R-SNO), R-nitrosoaminer (R-NNO), eller metal-NO-forbindelser (senere i manuskript benævnt "R- (X) -NO"), skal omregnes til gratis ingen gas for at kvantificere deres oprindelige beløb via CL. Omdannelse til NO opnås ved anvendelse af flere forskellige reducerende løsninger, afhængigt af arten af NO metabolit. Efter konvertering, er gratis NO gas udrenset fra reaktionsbeholderen ved en bæregas (Han, N2 eller Ar) i reaktionen kammer CL analysator hvor ozon (O 3) er kombineret med NO danner nitrogendioxid (NO 2) i aktiveret tilstand. Med tilbagevenden til grundtilstanden, NO 2 * udsender i infrarøde område og udsendt foton detekteres ved fotomultiplikator (PMT) i CL instrument. Intensiteten af emitteret lys er direkte proportional med NO-koncentration i reaktionskammeret, hvilket muliggør beregning af koncentrationen af de oprindelige arter anvender de rette kalibreringskurver.
I vores protokol, vi først til stede CL-baserede bestemmelse af nitrit og nitrat i de mest brugte kliniske – i blod og plasma, og så må vi drøfte, hvordan man bestemme disse ioner i vævsprøver. Vi forklarer også i detaljer, hvordan at bevare den oprindelige koncentration fysiologiske nitrit i nitrit-reaktive miljøer, såsom blod og rum, plasma og røde blodlegemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Prøver af alle løsninger (herunder vand), der bruges til at forberede, fortynde eller på anden måde behandle oprindelige prøver skal gemmes og kontrolleres for mulig nitrit eller (oftere) nitrat forurening. Vi fandt, at de fleste forurening kommer fra vand og mange kemikalier anvendes til behandling af prøven (ferricyanid navnlig) også indeholde signifikant mængde nitrat forurening i nogle partier, der forstyrrer den endogene nitrat bestemmelse. Vi kontroller…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere ønsker at anerkende kritiske bidrag Dr. A. Dejam og MM Pelletier i udviklingen af brugen af nitrit bevare løsning for nitrit målinger i blodet.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
Riferimenti
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
