تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة<sup> +</sup> خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ
Summary
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل للتعداد وتميز المكاك ريسوس خلايا CD8 + T ضد فيروس الإيدز. هذه المقالة هي مفيدة ليس فقط في مجال علم المناعة فيروس نقص المناعة البشرية، ولكن أيضا في مناطق أخرى من البحوث الطبية الحيوية حيث من المعروف أن استجابة خلايا CD8 + T للتأثير على نتائج المرض.
Abstract
وقد الببتيد كبيرا التوافق النسيجي الطبقة معقدة الأول (PMHC-I) tetramers أداة لا تقدر بثمن لدراسة CD8 + استجابات الخلايا التائية. لأن هذه الكواشف ربط مباشرة إلى مستقبلات الخلايا التائية على سطح CD8 + الخلايا اللمفاوية التائية، tetramers PMHC-I-وصفت تألقي تمكين كشف دقيق للمستضد (حج) -specific CD8 + T-الخلايا دون الحاجة إلى إعادة في المختبر -stimulation. وعلاوة على ذلك، وعندما يقترن متعددة الألوان التدفق الخلوي، ويمكن PMHC-I tetramer تلطيخ تكشف عن جوانب رئيسية من CD8 + T-خلايا حج محددة، بما في ذلك مرحلة التمايز، النمط الظاهري الذاكرة، وحالة التنشيط. وكانت هذه الأنواع من التحليلات مفيدة بشكل خاص في مجال علم المناعة HIV حيث CD8 + T الخلايا يمكن أن تؤثر على تطور مرض الإيدز. العدوى التجريبية من قرود المكاك ريسوس مع فيروس نقص المناعة القردي (SIV) يوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة المناعة الخلوية ضد فيروس الإيدز. ونتيجة لذلك، PROGRE كبيرأحرز SS في تحديد وتوصيف استجابات الخلايا التائية في هذا النموذج الحيواني. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لتعداد SIV محددة CD8 + الخلايا التائية في قرود المكاك ريسوس التي كتبها PMHC-I tetramer تلطيخ. يسمح لنا مقايسة في وقت واحد الكمي والذاكرة phenotyping من اثنين من السكان PMHC-I tetramer + CD8 + T-خلية في الاختبار، والتي قد تكون مفيدة لتتبع CD8 + استجابات الخلايا التائية SIV محددة الناتجة عن التطعيم أو العدوى SIV. وبالنظر إلى أهمية الرئيسيات غير البشرية في مجال البحوث الطبية الحيوية، وهذه المنهجية هي قابلة للتطبيق لدراسة CD8 + استجابات الخلايا التائية في إعدادات أمراض متعددة.
Introduction
تشمل CD8 + T الخلايا عنصرا حاسما في الجهاز المناعي التكيفي كما أنها تشارك في الورم المراقبة المناعة والمساهمة في القضاء على مسببات الأمراض داخل الخلايا 1. بعبارات بسيطة، CD8 + T-خلايا تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) التي تعترف على وجه التحديد الببتيد كبيرا التوافق النسيجي الطبقة معقدة الأول (PMHC-I) جزيئات موجودة على الغشاء البلازمي للخلايا المضيفة. منذ يتم الحصول على هذه الببتيدات من التحلل البروتيني من البروتينات توليفها التطور الطبيعي، وتوفر المجمعات PMHC-I سطح الخلية نافذة على البيئة داخل الخلايا. على عدوى فيروس، على سبيل المثال، فإن الخلايا المصابة عرض جزيئات MHC-I تحتوي على الببتيدات المستمدة من الفيروسات التي يمكن أن تكون بمثابة بروابط لTCRs أعرب عن طريق القيام بدوريات CD8 + الخلايا التائية. في الحدث CD8 + T-خلية الفيروس محددة اجه الخلية المصابة تقديم يجند PMHC-I، فسوف المشاركة TCR يؤدي في CD8 + تنشيط خلايا T وأولتييؤدي المطاف إلى استهداف تحلل الخلية. ونظرا للطبيعة الحساسة لهذه التفاعلات TCR / PMHC-I، وتحديد حجم ونوعية، والنمط الظاهري من الاستجابة CD8 + T الخلايا وغالبا ما تكشف عن خيوط مهمة حول الأمراض التي تصيب الإنسان.
حتى 1990s في وقت مبكر، وتحديد حجم CD8 + T-خلايا حج محددة تعتمد على مطالبة من الناحية الفنية فحص تخفيف الحد (LDA) 2،3. لم يكتف LDA تتطلب عدة أيام إلى أن تكتمل، إلا أنها أخفقت أيضا للكشف عن الخلايا التي تفتقر إلى إمكانية التكاثري. ونتيجة لذلك، LDA التقليل إلى حد كبير من وتيرة الفعلي للمستضد (حج) -specific CD8 + الخلايا التائية المشاركة في الاستجابة المناعية. على الرغم من أن تطوير ELISPOT والخلايا المقايسات خلوى تلطيخ تحسن كبير في القدرة على قياس المناعة الخلوية، وهذه الأساليب لا تزال هناك حاجة إلى تحفيز المختبر لقياس حج محددة خلايا تي 4. لم يكن حتى عام 1996 أن ألتمان، ديفيس، وكولeagues نشرت مقالة بارزة على الإبلاغ عن تطوير تكنولوجيا tetramer PMHC-I 5. حاسمة لنجاح هذا الأسلوب كان multimerization من جزيئات PMHC-I، الذي مدد نصف عمر التفاعلات TCR / PMHC-I، مما يقلل من احتمال tetramers PMHC-I تسقط خلال خطوات الغسيل من المقايسات تدفق cytometric. والميزة الرئيسية لtetramers PMHC-I على المقايسات المذكورة أعلاه هي القدرة على كشف بدقة حج محددة CD8 + T-الخلايا مباشرة خارج الجسم الحي دون الحاجة لفي المختبر إعادة التحفيز. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين PMHC-I tetramer تلطيخ مع متعدد الألوان تدفق سمحت الخلوي تحليلات مفصلة للمرحلة التمايز، النمط الظاهري الذاكرة، وحالة تفعيل CD8 + T-خلايا حج محددة 2-4. في ضوء التطورات التقنية الأخيرة لوصف ذخيرة CD8 + T-الخلية PMHC-I متعدد القسيمات تلطيخ 6، واتساع نطاق التطبيقات FOص هذه المنهجية من المرجح أن تستمر في التوسع.
وقد استفادت المناطق القليلة في البحوث الطبية الحيوية أكثر من PMHC-I tetramer تلطيخ من مجال علم المناعة فيروس نقص المناعة البشرية (7). على الرغم من CD8 + T الخلايا قد ارتبط زمنيا مع الرقابة الأولية فيروسية الدم فيروس نقص المناعة البشرية بحلول موعد نشر من قبل التمان، ديفيس، والزملاء 8،9، واستخدام tetramers PMHC-I في السنوات التي تلت ذلك توسعت بشكل كبير من فهمنا لل فيروس نقص المناعة البشرية محددة CD8 + استجابة خلايا T. على سبيل المثال، ساعدت PMHC-I tetramer تلطيخ التأكد من حجم قوة من CD8 + الاستجابات تي خلية الفيروس محددة في معظم الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية 10-12. كما سهلت هذه المنهجية توصيف بفيروس نقص المناعة البشرية و+ استجابات الخلايا التائية SIV محددة CD8 مقيدة جزيئات MHC-I المرتبطة تحكم عفوية من تكاثر الفيروس في غياب العلاج المضاد للفيروسات الرجعية لظاهرة تعرف باسم "سيطرة النخبة" <suص> 13-15. وعلاوة على ذلك، كانت tetramers PMHC-I دور أساسي في إنشاء محور مبرمجة الموت 1 (PD-1) / PD يجند 1 (PD-L1) كمسار عكسها لالنمط الظاهري مختلة من فيروس نقص المناعة البشرية محددة CD8 + الخلايا التائية في عدوى مزمنة غير المنضبط 16،17. بشكل جماعي، هذه الدراسات تؤكد فائدة tetramers PMHC-I لرصد CD8 + استجابات الخلايا التائية ضد فيروس الإيدز.
عدوى SIV التجريبية من قرود المكاك ريسوس (المكاك الخلاسي) يبقى أفضل نموذج حيواني لتقييم التدخلات المناعية ضد فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز 18،19. في السنوات ال 25 الماضية، تم إحراز تقدم كبير في تحديد وتوصيف SIV محددة CD8 + الخلايا التائية في هذا أنواع القرود، بما في ذلك اكتشاف الأليلات MHC-I وتعريف الببتيد ملزم الزخارف 13،20-27 . ونتيجة لذلك، وضعت tetramers PMHC-I لتحليل SIV محددة CD8 + T-خليةالردود في هذا النموذج الحيواني 28. تتم معظم هذه الكواشف من المنتجات الجينات من أربعة المكاك ريسوس الأليلات MHC-I: مامو-A1 * 001، مامو-A1 * 002: 01، مامو-B * 008: 01، ومامو-B * 017: 01. وتجدر الإشارة، قرود المكاك ريسوس لا يعبر عن MHC-C مكان 29. تم إنتاج الغالبية العظمى من tetramers PMHC-I المستخدمة في التجارب الحالية في مرفق المعاهد الوطنية للصحة Tetramer الأساسية في جامعة إيموري. ومع ذلك، فإن بعض هذه الكواشف، بما في ذلك مامو-A1 * 001 tetramers منضمة إلى سائد مناعيا حاتمة الكمامة CM9، ويمكن الحصول عليها إلا من مصادر تجارية بسبب اتفاقات الترخيص. باستخدام tetramers PMHC-I من أربعة الأليلات المكاك ريسوس المذكورة أعلاه، قمنا المذكورة بنجاح CD8 + الخلايا التائية ضد ما مجموعه 21 الحواتم سيف (الجدول 1)، التي يسببها التطعيم أو العدوى SIV الابتدائي 30،31 (مارتينز وآخرون آل. والملاحظات غير منشورة).
يوفر هذا المخطوط لبروتوكول tetramer تلطيخ PMHC-I الأمثل لتحديد تردد الذاكرة والنمط الظاهري من CD8 + T-خلايا SIV محددة في قرود المكاك ريسوس. يبدأ الفحص مع الاختيارية حضانة 30 دقيقة مع مثبط بروتين كيناز (PKI، وهنا، ويستخدم Dasatinib) من أجل تقليل TCR الداخلي، وبالتالي تحسين PMHC-I tetramer تلطيخ 32. كما هو موضح أدناه، وهذا العلاج مفيد خصوصا عند استخدام مامو-B * 017: 01 tetramers. كما تقدم إرشادات حول كيفية تسمية الخلايا مع tetramers PMHC-I-تألقي مترافق والاجسام المضادة (MABS). ويشمل هذا البروتوكول أيضا خطوة خلية permeabilization للكشف عن الخلايا للالمرتبطة انحلال خلوي جزيء باء granzyme (Gzm B). وأضاف ماب ضد CD3 في هذه الخطوة، وكذلك لتحسين الكشف عن هذه إشارات الجزيء TCR. كمرجع، يتم سرد كافة fluorochromes العاملين في هذا الفريق تلطيخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
على بعد خطوات قليلة في هذا الإجراء تستحق المناقشة لأنها حاسمة لتحقيق نتائج أفضل. أولا، لأن نوعية العينات البيولوجية هي مؤشرا قويا لنجاح أي تدفق cytometric فحص 38، يجب أن تؤخذ كل الحرص على التأكد من أن الخلايا هي قابلة للحياة وفي تعليق أثناء إجراء تلطيخ. وينطبق ذلك بشك…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ديفيد واتكينز لدعم التجارب التي مكنت من تحسين المنهجية الحالية. وأيد البحث عنها في هذا المطبوع جزئيا من خلال منحة التجريبية التي يقدمها المركز ميامي لأبحاث الإيدز من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة P30AI073961. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
