유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup> +</sup> 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포
Summary
여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.
Abstract
펩타이드 – 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I) 테트라는 CD8 + T 세포 반응을 연구하는 귀중한 도구가되고있다. 이러한 시약 직접 CD8 + T 림프구의 표면 상에 T 세포 수용체에 결합하므로, 형광 표지 pMHC-I의 테트라 항원의 정확한 검출은 (Ag) 시험관을 다시 할 필요없이 특이 적 CD8 + T 세포를 활성화 -자극. 유동 세포 계측법 멀티 컬러와 결합 될 때 또한, pMHC-I 테트라 머 염색은 분화 단계, 메모리 표현형 및 활성화 상태를 포함 AG-특정 CD8 + T 세포의 주요 측면을 공개 할 수 있습니다. CD8 + T 세포는 AIDS까지의 진행에 영향을 미칠 수있는 이런 종류의 분석은 HIV 면역학 분야에서 특히 유용왔다. 유인원 면역 결핍 바이러스와 붉은 털의 원숭이 (SIV)의 실험 감염은 에이즈 바이러스에 대한 세포 성 면역을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다. 그 결과, 상당한 PROGRESS는이 동물 모델에서 T 세포 반응을 정의 및 특징을했다. 여기에서 우리는 pMHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 SIV 특정 CD8 + T 세포를 열거하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 우리의 분석은 예방 접종 또는 SIV 감염에 의해 발생 SIV 특정 CD8 + T 세포 반응을 추적하는 데 유용 할 수 있습니다 테스트 당이 pMHC-I 사량 + CD8 + T 세포 인구의 동시 정량 및 메모리 표현형을 허용합니다. 생물 의학 연구 비인간 영장류의 관련성을 고려하여, 본 방법은 다수의 질병 설정에서 CD8 + T 세포 반응을 연구에 적용 할 수있다.
Introduction
그들은 종양 면역 감시에 참여하고 세포 내 병원균 1의 퇴치에 기여으로 CD8 + T 세포는 적응 면역 체계의 중요한 구성 요소를 포함한다. 간단히 말해서, CD8 + T 세포는 숙주 세포의 세포막에 존재하는 T 세포의 특이 적 펩티드 – 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I)를 인식 수용체 (TCR도) 분자를 표현한다. 이러한 펩티드는 내생 적으로 합성 된 단백질의 단백질 분해로부터 유도되기 때문에, 세포 표면 pMHC-I 복합체는 세포 내 환경에 창을 제공한다. 바이러스에 감염되면, 예를 들어, 감염된 세포는 CD8 + T 세포를 순찰로 표현 TCR도에 대한 리간드 역할을 할 수 있습니다 바이러스 유래 펩타이드를 포함하는 MHC-I 분자를 표시합니다. 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포가 pMHC-I 리간드를 제시 감염된 세포를 발견 한 경우, TCR 결합은 CD8 + T 세포 활성화 및 발생한다 ULTI후면부로 세포 용해를 대상으로지도한다. CD8 + T 세포 응답의 크기, 특이도, 표현형을 결정,이 TCR / pMHC-I 상호 작용의 중요한 특성을 감안할 때 종종 인간의 질병에 대한 중요한 단서를 공개 할 수 있습니다.
1990 년대 초까지),은 (Ag 관련 CD8 + T 세포의 정량은 기술적으로 까다로운 제한 희석 분석 (LDA) 2,3에 의존했다. LDA 수일 필요 않았다 완료해야 할뿐 아니라 증식 가능성 부족 셀을 검출하지 못했다. 그 결과, LDA는 크게 면역 반응에 참여하는 항원은 (Ag) 특이 적 CD8 + T 세포의 실제 주파수를 낮게. ELISPOT 세포 내 사이토 카인 염색 분석법의 개발이 크게 세포 면역을 측정 할 수있는 능력이 향상되지만, 이러한 방법은 여전히 AG-특정 T 세포 (4)를 정량화 시험 관내 자극 필요. 그것은 1996 알트만 데이비스, 그리고 콜까지되지 않았습니다eagues는 pMHC-I의 테트라 기술 (5)의 개발을보고 자신의 랜드 마크 기사를 발표했다. 이 기술의 성공에 중요하여 유세포 분석법 세척 단계에서 탈락 pMHC-I의 테트라 머의 확률을 감소 TCR / pMHC-I의 상호 작용의 반감기를 연장 pMHC-I 분자의 멀티 머화 하였다. 상기 분석을 통해 pMHC-I의 테트라 머의 주요 장점은 정확하게 관내 재 자극 없이도 직접 생체 AG-특정 CD8 + T 세포를 검출 할 수있는 능력이다. 또한, 멀티 – 컬러 pMHC-I 테트라 머 염색의 조합 계측법 분화 단계, 기억 표현형 및 AG-특정 CD8 + T 세포 2-4의 활성화 상태의 상세한 분석을 허용 한 흐름. 에 의해 CD8 + T 세포 레퍼토리의 특성에 대한 최근의 기술 발전에 비추어 pMHC-I는 응용 프로그램의 폭 FO 6 염색 다량 체R이 방법은 지속적으로 확대 할 전망이다.
생물 의학 연구에서 몇몇 지역은 HIV의 면역학 (7)의 필드보다 pMHC-I 테트라 머 염색에서 더 많은 혜택을. CD8 + T 세포가 일시적으로 알트만 데이비스, 동료 8,9에 의해 게시의 시간에 의해 HIV 바이러스 혈증의 초기 제어와 관련이 있었지만, 계속되는 년 pMHC-I의 사량의 사용은 크게 우리의 이해를 확장 CD8 + T 세포 반응 에이즈 관련. 예를 들어, I-pMHC 테트라 머 염색은 대부분의 HIV 감염자 10-12에서 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 강력한 크기를 확인 도왔다. 이 방법은 "엘리트 제어"로 알려진 항 레트로 바이러스 요법 – 현상의 부재하에 바이러스 복제의 자발적인 제어와 관련된 MHC-I 분자에 의해 제한 HIV- 및 SIV 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 특성을 용이 <suP> 13-15. 또한, pMHC-I의 사량이 조절되지 않는 만성 감염 HIV 관련 CD8 + T 세포의 기능 장애 표현형에 대한 가역 경로로 프로그램 된 죽음 1 (PD-1) / PD 리간드 1 (PD-L1) 축 설정에 쓸모 있었다 16, 17. 종합적으로, 이러한 연구는 AIDS 바이러스를 CD8 + T 세포 반응을 모니터링 pMHC-I의 테트라 머의 유용성을 강조한다.
붉은 털 원숭이 원숭이 (Macaca의 mulatta)의 실험 SIV 감염은 HIV / AIDS (18, 19)에 대해 면역 개입을 평가하는 가장 좋은 동물 모델 남아있다. 지난 25 년 동안 상당한 진보는 MHC-I 대립 유전자의 발견과 펩티드 결합 모티프 13,20-27를 정의를 포함하여,이 원숭이 종의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 식별 및 특성 이루어진 것으로 . 그 결과, pMHC-I의 사량은 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 분석을 위해 개발되어왔다이 동물 모델 (28)에 응답. Mamu-A1 * 002, Mamu-A1 * 001 : 01, Mamu-B의 * 008 :이 시약의 대부분은 네 개의 붉은 털 원숭이 MHC-I 대립 유전자의 유전자 산물 만들어진 01, 및 Mamu-B * 017 : 01. 참고로, 붉은 털 원숭이는 MHC-C의 궤적 (29)을 표현하지 않습니다. 본 실험에 사용 된 pMHC-I의 사량의 대부분은에 모리 대학에서 NIH 테트라 머 핵심 시설에서 생산되었다. 그럼에도 불구하고, 면역 개그 CM9 에피토프에 결합 Mamu-A1 * 001 사량을 포함하여 이러한 시약 중 일부는, 오직 인해 라이선스 계약에 상용 소스에서 얻을 수 있습니다. 네 개의 붉은 털 원숭이의 대립 유전자의 사용 pMHC-I의 테트라 우리는 성공적으로 예방 접종 또는 기본 SIV 감염 30, 31 (마틴 등등에 의해 유도 된 21 SIV 항원 결정기 (표 1)의 총에 CD8 + T 세포를 열거 한 위 알., 게시되지 않은 관찰).
본 원고는 제공붉은 털 원숭이의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 빈도 및 메모리 표현형을 결정하기위한 최적화 pMHC-I 테트라 머 염색 프로토콜. TCR 내재화를 감소시켜 pMHC I-32 염색 테트라을 향상시키기 위해 상기 분석은 단백질 키나아제 억제제 (여기서, 프라이 셀이 사용되는 PKI)와 선택적인 30 분 동안 배양으로 시작한다. 사량 01 : 후술하는 바와 같이 Mamu-B의 *를 017을 사용할 때,이 처리에 특히 유용하다. Fluorochrome과 접합 pMHC-I의 사량과 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 세포를 레이블하는 방법에 대한 지침도 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 세포 용해 – 관련 분자 그랜 자임 B (GZM B)의 세포 검출 용 셀 permeabilization 단계를 포함한다. CD3에 대한 단클론 항체는이 TCR 신호 전달 분자의 검출을 향상시킬뿐만 아니라,이 단계에서 첨가된다. 참고로,이 염색 패널에 사용 된 모든 형광 색소가 나열됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차 매력 토론에서 몇 단계는 최적의 결과를 산출하기위한 중요하다있다. 생물학적 시료의 품질이 어떤 유세포 분석 (38)의 성공 강한 예측이기 때문에 먼저 모든 치료는 세포의 염색 과정 중에 생존 및 정지되도록주의해야한다. 그들은 응집하는 경향이며, 일반적으로 죽은 세포의 높은 숫자를 포함하기 때문에 냉동 보관 샘플로 작업 할 때 특히 관련이있다. 이러한 경우, 이전 pMHC-I ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 본 방법의 최적화를 활성화 실험을 지원하기 위해 데이비드 왓킨스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30AI073961에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 AIDS 연구를위한 마이애미 센터에서 제공하는 파일럿 부여에 의해 부분적으로 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
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