Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8<sup> +</sup> T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring
Summary
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.
Abstract
Peptide-major histocompatibility complex klasse I (pMHC-I) tetrameren heb een waardevol instrument om CD8 + T-cel reacties te bestuderen. Omdat deze reagentia direct binden aan T-cel receptoren op het oppervlak van CD8 + T-lymfocyten, fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren kan de nauwkeurige detectie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro re -stimulation. Bovendien, in combinatie met multi-color flowcytometrie kan pMHC-I tetrameer kleuring blijkt sleutelaspecten van Ag-specifieke CD8 + T-cellen, waaronder differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus. Deze soorten analyses vooral nuttig op het gebied van HIV immunologie is wanneer CD8 + T-cellen progressie beïnvloeden AIDS. Experimentele infectie van rhesus makaken met simian immunodeficiency virus (SIV) biedt een waardevol instrument om cellulaire immuniteit tegen het AIDS-virus te bestuderen. Daardoor aanzienlijke progress is gemaakt bij het bepalen en karakteriseren van T-cel responsen in dit diermodel. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor sommen SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken door pMHC-I tetrameer kleuring. De assay maakt de gelijktijdige kwantificering en geheugen fenotypering van twee pMHC-I tetrameer + CD8 + T-celpopulaties per test, die bruikbaar zijn voor het bijhouden van SIV-specifieke CD8 + T-cel responsen opgewekt door vaccinatie of SIV infectie kan zijn. Gezien het belang van niet-menselijke primaten in biomedisch onderzoek, deze methode is toepasbaar voor het bestuderen van CD8 + T-cel responsen in meerdere instellingen ziekte.
Introduction
CD8 + T-cellen een belangrijke component van het adaptieve immuunsysteem voor deelname tumor immune surveillance en dragen bij aan de uitroeiing van intracellulaire pathogenen 1. Eenvoudig gezegd, CD8 + T-cellen brengen T-celreceptoren (TCR's) die specifiek herkennen peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) moleculen aanwezig op het plasmamembraan van gastheercellen. Omdat deze peptiden zijn afgeleid van de proteolyse van endogeen gesynthetiseerde eiwitten, celoppervlak pMHC-I complexen een venster in de intracellulaire omgeving. Na virusinfectie, bijvoorbeeld geïnfecteerde cellen MHC-I moleculen die virus afgeleide peptiden die als liganden voor door TCR patrouilleren CD8 + T-cellen tot expressie kunnen dienen weergeven. Bij een virus-specifieke CD8 + T-cel tegenkomt een geïnfecteerde cel presenteert het pMHC-I ligand, zal TCR betrokkenheid resulteren in CD8 + T-cel activatie en ultiveer leiden tot cellysis richten. Gezien het grote belang van deze TCR / pMHC-I interacties bepalen de grootte, specificiteit en fenotype reageren CD8 + T-cellen vaak kunnen belangrijke aanwijzingen over menselijke ziektes.
Tot begin 1990 kwantificering van Ag-specifieke CD8 + T-cellen gebruikt de technisch veeleisende beperkende verdunningstest (LDA) 2,3. Niet alleen heeft de LDA vereisen een aantal dagen worden afgerond, maar ook nagelaten om cellen die proliferatieve potentiële ontbrak op te sporen. Hierdoor LDA sterk onderschat de werkelijke frequentie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen die aan een immuunrespons. Hoewel de ontwikkeling van ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring assays sterk het vermogen om cellulaire immuniteit meten verbeterde Deze methoden verzet in vitro stimulatie te kwantificeren Ag-specifieke T-cellen 4. Het was pas in 1996 dat Altman, Davis, en colleagues publiceerden hun landmark artikel rapporteren van de ontwikkeling van de pMHC-I tetrameer technologie 5. Cruciaal voor het succes van deze techniek was de multimerisatie van pMHC-I moleculen die de halfwaardetijd van TCR / pMHC-I interacties uitgebreid, waardoor de kans op pMHC-I tetrameren vallen tijdens de wasstappen van flowcytometrische assays verminderen. Het belangrijkste voordeel van pMHC-I tetrameren via voornoemde assays is de mogelijkheid om direct ex vivo nauwkeurige opsporing Ag-specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro her-stimulatie. Bovendien is de combinatie van pMHC-I tetrameer kleuring met multi-color flowcytometrie heeft gedetailleerde analyse van het differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus van Ag-specifieke CD8 + T-cellen 2-4 toegestaan. In het licht van de recente technische ontwikkelingen voor het karakteriseren van CD8 + T-cel repertoire pMHC-I multimeer kleuring 6, de breedte van de aanvragen for deze methode zal waarschijnlijk blijven uitbreiden.
Er zijn maar weinig gebieden in het biomedisch onderzoek zijn meer geprofiteerd van pMHC-I tetrameer kleuring dan het gebied van HIV immunologie 7. Hoewel CD8 + T-cellen waren tijdelijk geassocieerd met de eerste controle van HIV viremie ten tijde van de publicatie door Altman, Davis en collega 8,9, het gebruik van pMHC-I tetrameren in de daaropvolgende jaren aanzienlijk uitgebreid inzicht in de HIV-specifieke CD8 + T-celrespons. Zo pMHC-I tetrameer kleuring geholpen bevestigen de robuuste afmetingen van virus-specifieke CD8 + T-cel responsen in de meeste HIV-geïnfecteerden 10-12. Deze werkwijze vergemakkelijkt eveneens de karakterisering van HIV en SIV-specifieke CD8 + T-celresponsen beperkt door MHC-I-moleculen geassocieerd met spontane controle van virale replicatie in de afwezigheid van antiretrovirale therapie-depressiviteit en "elite control" <sup> 13-15. Verder pMHC-I tetrameren waren instrumentaal bij de vaststelling van de geprogrammeerde dood 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) as als een omkeerbare route voor de disfunctionele fenotype van HIV-specifieke CD8 + T-cellen in ongecontroleerde chronische infectie 16,17. Tezamen zijn deze studies onderstrepen het nut van pMHC-I tetrameren toezicht CD8 + T-celresponsen tegen het AIDS-virus.
Experimentele SIV infectie van rhesus makaken (Macaca mulatta) blijft de beste diermodel voor het evalueren van immune interventies tegen HIV / AIDS 18,19. In de afgelopen 25 jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de identificatie en karakterisering van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in deze apensoorten, waaronder de ontdekking van MHC-I-allelen en de definitie van de peptide binding motieven 13,20-27 . Als gevolg daarvan hebben pMHC-I tetrameren ontwikkeld voor de analyse van SIV-specifieke CD8 + T-cellreacties in dit diermodel 28. De meeste van deze sera worden gemaakt van de genproducten van vier rhesus macaque MHC-I allelen: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, en Mamu-B * 017: 01. Van de nota, doe resusapen geen MHC-C locus 29 te drukken. De overgrote meerderheid van de pMHC-I tetrameren gebruikt in de onderhavige experimenten werden geproduceerd op de NIH tetrameer Core Facility Emory University. Toch heeft een aantal van deze reagentia, met inbegrip van Mamu-A1 * 001 tetrameren gebonden aan de immunodominante Gag CM9 epitoop, kan alleen worden verkregen uit commerciële bronnen te wijten aan licentieovereenkomsten. Gebruik pMHC-I tetrameren van de vier rhesus macaque allelen bovenstaande, hebben we met succes genoemde CD8 + T-cellen tegen een totaal van 21 epitopen SIV (tabel 1), die werden geïnduceerd door vaccinatie of primaire SIV infectie 30,31 (Martins et al., ongepubliceerde waarnemingen).
De huidige manuscript voorziet in eengeoptimaliseerde pMHC-I tetrameer kleuring protocol voor het bepalen van de frequentie en het geheugen fenotype van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken. De bepaling begint met een verkozen 30 min incuberen met een proteïne kinase remmer (PKI, hier Dasatinib wordt gebruikt) om TCR internalisatie verlagen en zo verbeteren pMHC-I tetrameer kleuring 32. Zoals hieronder beschreven, deze behandeling is vooral nuttig bij gebruik Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Instructies over hoe de cellen met fluorochroom-geconjugeerde pMHC-I tetrameren en monoklonale antilichamen (mAbs) te labelen zijn ook aanwezig. Dit protocol een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire detectie van de cytolyse-geassocieerde molecule granzyme B (GZM B). Het mAb tegen CD3 toegevoegd in deze stap ook de detectie van deze TCR signaalmolecuul verbeteren. Als referentie zijn alle fluorochromen die in deze kleuring paneel weergegeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een paar stappen in deze procedure verdienste discussie als ze zijn van cruciaal belang voor een optimaal resultaat opleveren. Ten eerste, omdat de kwaliteit van de biologische monsters is een sterke voorspeller van het succes van elke flowcytometrische bepaling 38, reinigings- moet worden gezorgd dat de cellen levensvatbaar zijn en in suspensie tijdens de kleuringsprocedure. Dit is met name van belang bij het werken met gecryopreserveerde monsters omdat ze meer vatbaar voor klonteren en typisch hogere aantal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen graag David Watkins bedanken voor de ondersteuning van de experimenten die de optimalisatie van de huidige methodiek ingeschakeld. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd mede ondersteund door een pilot subsidie verstrekt door de Miami Center for AIDS Research van de National Institutes of Health onder award nummer P30AI073961. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
