ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup> +</sup> T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.
Abstract
פפטיד-מרכזי histocompatibility מורכבת אני בכיתה (pMHC-I) tetramers היה כלים רבים ערך כדי ללמוד CD8 + תגובות תאי T. בגלל ריאגנטים אלה ישירות לאגד קולטני תאי T על פני השטח של CD8 + לימפוציטים מסוג T, שכותרתו fluorochrome tetramers pMHC-לי לאפשר זיהוי מדויק של אנטיגן (Ag) -specific CD8 + T-תאים ללא צורך במבחנה מחדש -גְרִיָה. יתר על כן, בשילוב עם צבע רב cytometry זרימה, pMHC-לי tetramer מכתים יכול לחשוף היבטים מרכזיים של Ag ספציפי CD8 + T-תאים, כולל שלב התמיינות, פנוטיפ זיכרון, מצב ההפעלה. מחקרים מסוג זה כבר שימושי במיוחד בתחום האימונולוגיה HIV שבו CD8 + T-תאים יכולים להשפיע על התפתחות לאיידס. זיהום ניסיוני של קופי רזוס בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) מספק כלי רב ערך כדי ללמוד חסינות הסלולר נגד נגיף האיידס. כתוצאה מכך, progre ניכרss נעשה בהגדרה ואפיון תגובות T-cell במודל חיה זו. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס ידי מכתים tetramer pMHC-לי. Assay שלנו מאפשר phenotyping כימות וזיכרון סימולטני של שתי אוכלוסיות pMHC-לי tetramer + CD8 + T-cell לכל מבחן, אשר יכול להיות שימושי לצורך מעקב תגובות SIV ספציפי CD8 + T-cell שנוצר על ידי חיסון או זיהום SIV. בהתחשב הרלוונטי של פרימטים לא אנושיים במחקר ביו, מתודולוגיה זו ישימה ללימוד תגובות CD8 + T-cell במסגרות מחלה נפוצה.
Introduction
CD8 + T-תאים מהווים מרכיב חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית כפי שהוא להשתתף מעקב חיסוני גידול ולתרום מיגור פתוגנים תאיים 1. במילות פשוטות, CD8 + T-תאים לבטא קולטנים T-cell (TCRs) כי דווקא מכירים בכיתה מורכבת histocompatibility-מרכזי פפטיד אני (pMHC-I) מולקולות נוכחיות מופעל על הממברנה של תאי מארחים. מאז פפטידים אלה נגזרים proteolysis של חלבונים מסונתזים באופן אנדוגני, pMHC-I פני תא מתחמים פותחים בפנינו צוהר אל הסביבה התאית. עם זיהום בנגיף, למשל, תאים נגועים יציגו מולקולות MHC-I המכילות פפטידים שמקורם וירוס שיכול לשמש ligands עבור TCRs שהביע מסיירי CD8 + T לתאים. במקרה וירוס ספציפי CD8 + T-cell פוגש תא נגוע ההצגה ליגנד pMHC-I שלה, מעורבות TCR תגרום CD8 + T-cell הפעלת ultimately להוביל למקד תמוגה התא. בהתחשב באופי הקריטי של אינטראקציות TCR / pMHC-לי אלה, לקביעת הגודל, הסגוליים פנוטיפ להגיב CD8 + T-תאים לעתים קרובות יכול לחשוף רמזים חשובים על מחלות אנושיות.
עד תחילת 1990, כימות של Ag ספציפי CD8 + T-תאי הסתמכה על assay דילול בדרישה להגביל טכנית (LDA) 2,3. לא זו בלבד LDA לדרוש כמה ימים להסתיים, זה גם לא הצליח לאתר תאים חסרי פוטנציאל שגשוג. כתוצאה מכך, LDA לזלזל בהרבה התדירות בפועל של אנטיגן (Ag) CD8 + T-תאי -specific השתתפות תגובה חיסונית. למרות הפיתוח של ELISPOT מבחני מכתים ציטוקינים תאיים מאוד שיפר את היכולת למדוד חסינות הסלולר, שיטות אלה עדיין יש צורך גירוי במבחנה לכימות Ag ספציפי מתאי T 4. זה לא היה עד 1996 אלטמן, דייויס, ואת הפיצוץeagues פרסם מאמר ציון הדרך שלהם ולדווח על ההתפתחות של טכנולוגית tetramer pMHC-לי 5. קריטי להצלחה של טכניקה זו הייתה multimerization של מולקולות pMHC-I, אשר האריך את זמן מחצית החיים של אינטראקציות TCR / pMHC-I, ובכך להפחית את ההסתברות של tetramers pMHC-לי ליפול במהלך השלבים כביסה של מבחני תזרים cytometric. היתרון העיקרי של tetramers pMHC-לי על מבחני הנ"ל היא היכולת לזהות במדויק Ag ספציפי CD8 + T-תאים ישירות vivo לשעבר ללא צורך גירוי מחדש במבחנה. מעבר לכך, השילוב של מכתים tetramer pMHC-לי עם צבע רב cytometry זרימה אפשר ניתוחים מפורטים של שלב הבידול, פנוטיפ זיכרון, מצב הפעלה של Ag ספציפי CD8 + T-תאי 2-4. לאור התקדמות טכנית האחרונה לאפיון רפרטוארי CD8 + T-cell ידי pMHC-לי multimer מכתים 6, את רוחב היריעה של יישומי FOr מתודולוגיה זו צפויה להימשך מתרחבת.
אזורים מעטים במחקר ביו היה ליהנות יותר מכתים tetramer pMHC-לי מאשר בתחום האימונולוגיה HIV 7. למרות CD8 + T לתאים היו קשורים באופן זמני באמצעות השלט הראשוני של viremia HIV עד מועד הפרסום ידי אלטמן, דייויס, ועמיתיו 8,9, השימוש tetramers pMHC-לי בשנים שלאחר מכן הרחיב את הבנתנו משמעותית של תגובת CD8 + T-cell הספציפית ל- HIV. לדוגמא, מכתים tetramer pMHC-עזר לאשר את הגודל החזק של תגובות וירוס ספציפי CD8 + T-cell ברוב האנשים שנדבקו ב- HIV 10-12. מתודולוגיה זו גם כדי להקל על האפיון של HIV- ו SIV ספציפי תגובות CD8 + T-cell המוגבל על ידי מולקולות MHC-I הקשורות בשליטה ספונטנית של תרבות נגיף בהעדר-טיפול בתופעה תרופתית המכונה "שליטת אליטה" <sup> 13-15. יתר על כן, tetramers pMHC-לי סייע בהקמת מוות המתוכן 1 (PD-1) / PD ליגנד 1 (PD-L1) הציר כמו מסלול הפיך עבור הפנוטיפ מתפקדת הספציפי ל- HIV CD8 + T-תאי זיהום כרוני בלתי מבוקר 16,17. ככלל, מחקרים אלה מדגישים את התועלת של tetramers pMHC-לי לניטור CD8 + T-cell תגובות נגד נגיף האיידס.
זיהום ניסיוני SIV של קופי רזוס (מולאטית מאכאכה) נשאר מודל החיה הכי הטוב להערכת התערבויות חיסון נגד HIV / איידס 18,19. ב -25 השנים האחרונות, התקדמות משמעותית נעשתה זיהוי ואפיון של SIV ספציפי CD8 + T-תאי במינים זה קוף, לרבות גילוי אללים MHC-I ו- ההגדרה של מוטיבים מחייב פפטיד 13,20-27 . כתוצאה מכך, tetramers pMHC-לי פותח לניתוח SIV הספציפי CD8 + T-cellתגובות במודל החיה הזאת 28. רוב ריאגנטים אלה עשויים המוצרים הגן של ארבעה אללים רזוס מקוק MHC-I: ממו-A1 * 001, ממו-A1 * 002: 01, * ממו-B 008: 01, ו ממו-B * 017: 01. ראוי לציין, קופי רזוס מחווים מוקד MHC-C 29. הרוב המכריע של tetramers pMHC-השתמשתי בניסויים הנוכחי הופקו במתקן Core NIH tetramer באוניברסיטת אמורי. עם זאת, חלק ריאגנטים אלה, כולל ממו-A1 * 001 tetramers מאוגד epitope Gag CM9 immunodominant, ניתן להשיג רק ממקורות מסחריים בשל הסכמי רישוי. Tetramers pMHC-לי שימוש של ארבעה אללים מקוק רזוס המפורטים לעיל, יש לנו המנויים בהצלחה CD8 + T-תאי נגד סך של 21 אפיטופים SIV (טבלה 1), שהיו המושרה על ידי חיסון או זיהום SIV העיקרי 30,31 (et מרטינס al., תצפיות לא פורסם).
כתב היד הנוכחי מספקתpMHC-לי tetramer מכתים מותאם פרוטוקול לקביעת פנוטיפ תדירות וזיכרון של SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס. את assay מתחיל עם הדגירה אלקטיבי 30 דקות עם מעכב קינאז חלבון (PKI; כאן, dasatinib משמש) על מנת להקטין הפנמה TCR ובכך לשפר pMHC-לי tetramer מכתים 32. כפי שנראה בהמשך, הטיפול הזה הוא שימושי במיוחד בעת השימוש ממו-B * 017: 01 tetramers. הוראות כיצד לתייג את התאים עם tetramers fluorochrome מצומדות pMHC-I ו- נוגדנים חד שבטיים (מבז) ניתנים גם. פרוטוקול זה כולל גם צעד התא permeabilization לאיתור התאי של B granzyme המולקולה הקשורים cytolysis (Gzm B). מב נגד CD3 מתווספת בשלב זה, כמו גם כדי לשפר את היכולת לזהות מולקולת איתות TCR זה. כהפניה, כל fluorochromes מועסק לוח מכתים זה מפורט.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמה צעדים שידונו בו הליך זה כיוון שהן חיוניות על כניעתה תוצאות אופטימליות. ראשית, מאז איכות הדגימות הביולוגיות היא מנבא חזק של ההצלחה של כל assay תזרים cytometric 38, כל הטיפול יש לנקוט כדי להבטיח כי התאים הם קיימא וב ההשעיה במהלך ההליך המכתים. זה רלוונטי במיוחד כאשר עוב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות דוד ווטקינס לתמיכה בניסויים שאפשרו אופטימיזציה של המתודולוגיה הנוכחית. מחקר מדווח בפרסום זה מומן בחלקו על ידי מענק טייס שמספק מרכז מיאמי לאיידס מחקר של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30AI073961. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
