Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8⁺ Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Summary

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для нумерации и характеризующих макаки – резус CD8 ⁺ Т – клеток против вируса СПИДа. Эта статья полезна не только к области иммунологии ВИЧ, но и в других областях биомедицинских исследований , где ответы CD8 ⁺ Т – клеток , как известно, влияют на исход заболевания.

Abstract

Пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) тетрамеры был бесценным инструментом для изучения ответов CD8 ⁺ Т-клеток. Поскольку эти реагенты непосредственно связываются с рецепторами Т-клеток на поверхности CD8 ⁺ Т-лимфоцитов, Флуорохром-меченых тетрамеров ПКИКЖ-I позволяют точное обнаружение антигена (Ag) -специфический CD8 ⁺ Т-клетки без необходимости повторной ин витро -стимуляция. Кроме того, в сочетании с многоцветной проточной цитометрии, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивание может выявить ключевые аспекты Ag-специфических CD8 ⁺ Т-клеток, в том числе стадии дифференцировки, фенотипом памяти, а также состояние активации. Эти виды анализов были особенно полезны в области иммунологии ВИЧ , где CD8 ⁺ Т-клетки могут влиять на развитие СПИДа. Экспериментальное заражение макак-резусов с вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) является бесценным инструментом для изучения клеточного иммунитета против вируса СПИДа. В результате значительная PROGRESS было сделано в определении и характеризующее Т-клеточного ответа в данной животной модели. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для перечисления SIV-специфических CD8 + T-клеток в макак-резусов с помощью окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Наш анализ позволяет одновременно количественной оценки и памяти Фенотипирование двух популяций ПКИКЖ-I тетрамер + CD8 ⁺ T-клеток на тест, что может быть полезно для отслеживания SIV-специфических Т-клеточного ответа CD8 ⁺ , сгенерированные с помощью вакцинации или SIV инфекции. Учитывая актуальность приматах в биомедицинских исследованиях, эта методика применима для изучения ответов CD8 ⁺ Т-клеток в различных условиях болезни.

Introduction

CD8 ⁺ Т-клетки содержат важнейший компонент адаптивной иммунной системы , поскольку они участвуют в опухоли иммунного надзора и способствовать искоренению внутриклеточных патогенов ^1. Проще говоря, CD8 ⁺ Т-клетки экспрессируют рецепторы Т-клеток (TCR) , которые специфически распознают пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) молекулы , присутствующие на плазматической мембране клеток – хозяев. Так как эти пептиды являются производными от протеолиза эндогенно синтезированных белков, клеточной поверхности ПКИКЖ-I комплексы обеспечивают окно в внутриклеточной среде. При вирусной инфекции, например, инфицированные клетки будут отображать молекулы MHC-I , содержащих вирусные производные пептидов , которые могут служить в качестве лигандов для ТКР , выраженные патрулируя CD8 ⁺ Т-клеток. В случае вирус-специфических CD8 ⁺ Т-клетка встречается инфицированной клетки представляет свои ПКИКЖ-I – лиганд, ТКР взаимодействие будет приводить к активации ⁺ Т-клеток CD8 и ULTIзительно приводят к целевой лизис клеток. Учитывая критический характер этих взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, определение величины, специфичность и фенотип реагирования CD8 ⁺ Т-клетки часто могут выявить важные подсказки о заболеваниях человека.

До начала 1990 – х годов, количественное определение Ag-специфических CD8 ⁺ Т-клеток не полагались на технически сложных предельного анализа разбавления (LDA) ^2,3. Мало того, что LDA требуется несколько дней, чтобы завершить, он также не удалось обнаружить клетки, которые испытывали недостаток пролиферативный потенциал. В результате, ЛДА значительно недооценивают реальную частоту антигена (Ag) -специфические CD8 ⁺ Т-клеток , участвующих в иммунной реакции. Хотя развитие ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокина анализов значительно улучшило способность измерить клеточный иммунитет, эти методы все еще требуется в пробирке стимуляции для количественной оценки антиген-специфические Т-клетки ^4. Он не был до 1996 года, что Альтман, Дэвис, и сбeagues опубликовал свою основополагающую статью , сообщающее развитие технологии ПКИКЖ-I тетраметра ^5. Критическое значение для успеха этого метода была мультимеризация молекул ПКИКЖ-I, что привело к увеличению полураспада взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, тем самым снижая вероятность тетрамеров ПКИКЖ-I падает во время стадии промывки в проточной цитометрии анализов. Главное преимущество тетра- ПКИКЖ- класса над вышеупомянутыми анализов является способность точно обнаружить антиген-специфические CD8 ⁺ Т-клетки непосредственно ех естественных условиях без необходимости экстракорпорального повторной стимуляции. Кроме того, сочетание тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I с многоцветной проточной цитометрии позволило подробный анализ стадии дифференцировки, фенотип памяти и статус активации Ag-специфических CD8 ⁺ Т-клеток ^2-4. В свете последних технических достижений для характеристики CD8 ⁺ Т-клеток с помощью репертуаров рМНС-I мультимеру окрашивания ^6, широту применения Foг эта методология, вероятно, продолжит расширяться.

Мало областей в биомедицинских исследованиях получили пользу больше от тетрамера окрашивания ПКИКЖ-I , чем области ВИЧ иммунологии ^7. Хотя CD8 ⁺ Т-клетки были временно связаны с начальным контролем виремии ВИЧ к моменту публикации Альтман, Дэвис и его коллеги ^8,9, использование тетрамеров ПКИКЖ-I в последующие годы значительно расширили наше понимание ВИЧ-специфических CD8 ⁺ Т-клеточный ответ. Например, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания помог подтвердить надежный размер вирус-специфических ответов CD8 ⁺ Т-клеток у большинства ВИЧ-инфицированных лиц ^10-12. Эта методика также способствовала характеристика ВИЧ и SIV-специфических Т-клеточных реакций CD8 ⁺ ограниченное молекулами MHC-I , связанных с самопроизвольным контролем репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии-явление , известное как "элитный контроль" <suр> 13-15. Кроме того, тетрамеры ПКИКЖ-I сыграли важную роль в создании оси запрограммированной смерти 1 (PD-1) / PD – лиганд 1 (PD-L1) в качестве обратимого пути для дисфункциональной фенотипа ВИЧ-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в неконтролируемой хронической инфекции ^16,17. В совокупности эти исследования подчеркивают полезность тетрамеров ПКИКЖ-I для мониторинга ответов CD8 ⁺ Т-клеток против вируса СПИДа.

Экспериментальная SIV инфекции макак – резусов (Macaca мулатка) остается лучшей животной моделью для оценки иммунного вмешательства против ВИЧ / СПИДа ^18,19. За последние 25 лет достигнут значительный прогресс был достигнут в области идентификации и определения характеристик SIV-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в этой обезьяны видов, в том числе открытие аллели MHC-I и определения пептидсвязывающий мотивов ^13,20-27 , В результате, тетрамеры ПКИКЖ-I были разработаны для анализа SIV-специфических CD8 ⁺ Т-клетокответы в этой животной модели ^28. Большинство из этих реагентов изготовлены из генных продуктов из четырех макак резус аллелями MHC-I: Маму-А1 * 001, Маму-А1 * 002: 01, Маму-B * 008: 01, и Маму-B * 017: 01. Следует отметить, что макак не выражают локус MHC-C ^29. Подавляющее большинство из тетрамеров ПКИКЖ-I, используемые в настоящих экспериментах были произведены на NIH тетрамеров основной комплекс в Университете Эмори. Тем не менее, некоторые из этих реагентов, в том числе Маму-A1 * 001 тетрамеров связанных с иммунодоминантном Gag CM9 эпитоп, могут быть получены только из коммерческих источников, из-за лицензионных соглашений. Использование тетрамеры ПКИКЖ-I из четырех макак резус аллелями , перечисленных выше, мы успешно перечислены CD8 ⁺ Т-клеток против в общей сложности 21 SIV эпитопов (таблица 1), которые были вызваны вакцинацией или первичной инфекции SIV ^30,31 (Мартинс и др и др., неопубликованные данные).

Настоящая рукопись обеспечиваетоптимизированный протокол тетрамер окрашивания ПКИКЖ-я для определения частоты и памяти фенотип ВИО-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в макак – резусов. Анализ начинается с факультативный 30 мин инкубации с ингибитором протеинкиназы (ИПК, здесь используется Дазатиниб) с целью уменьшения интернализации ТКР и тем самым улучшить ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания ^32. Как описано ниже, эта процедура особенно полезна при использовании Маму-B * 017: 01 тетрамеров. Также предоставляются инструкции о том, как маркировать клетки с флуорохромом конъюгированный тетрамеров ПКИКЖ-I и моноклональных антител (мАт). Этот протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного обнаружения цитолиза-ассоциированной молекулы гранзимом (GZM B). Моноклональное антитело против CD3 добавляется на этом этапе, а также улучшить обнаружение этой сигнальной молекулы TCR. В качестве ссылки, все флуорохромы, используемые в этом окрашивающим панели перечислены.

Protocol

В мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцы, используемые в этой рукописи были получены из индийских макак хранящаяся в Национальном исследовательском центре приматов Висконсин. Эти животные были воспитывающихся в соответствии с отчетом Weatherall согласно протоколу , утвержденному…

Representative Results

Протокол , описанный здесь , был использован для определения величины и памяти фенотип поствакцинальный, Gag CM9-специфических ответов CD8 + Т-клеток в Маму-A1 * 001 + макаки – резус. Для этого анализа, БТР-конъюгирован Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 тетрамер был использован в 8-цветной …

Discussion

Несколько шагов в этой процедуре заслуживают обсуждения, поскольку они имеют решающее значение для приносит оптимальные результаты. Во- первых, поскольку качество биологических образцов является сильным прогностическим фактором успеха любого потока цитометрии анализа ^38, все н…

Materials

Dasatinib	Axon medchem	Axon 1392	Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C
RPMI w/ Glutamax	gibco/ Life Technologies	61870-036	Must be stored at 4 °C
Heat Inactivated FBS	gibco/ Life Technologies	10082-147	Must be stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B	Lonza	17-745E	Must be stored at 4 °C
DMSO, Anhydrous	Life Technologies	D12345	Store at room temperature.
5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes	VWR	60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers	NIH Tetramer Core or MBL, Inc.		Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs	Various companies		Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	l34957	Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer	BD Biosciences	563794	Must be stored at  4 °C
Phosphate Buffered Saline	VWR	97064-158	Store at room temperature
Albumine Bovine	VWR	700011-230	Must be stored at  4 °C
Sodium Azide	VWR	97064-646	Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach	VWR	89501-620	Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Store at room temperature
Permeabilization Solution 2	BD Biosciences	340973	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5mL screw top	VWR	72.692.005
2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes	Eppendorf	22431048	The use of Sterile microtubes is preffered
Vortex mixer	To discretion of scientist
Biosafety Cabinet	To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge	To discretion of scientist
Centrifuge	To discretion of scientist
4 °C  refrigerator	To discretion of scientist
BD LSR II	BD Biosciences		Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
Incubator			Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software	BD Biosciences
Flowjo software version 9.6	Flowjo		Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
Micropippette tips