Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica<sup> +</sup> Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción
Summary
A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.
Abstract
I (pMHC-I) tetrámeros de histocompatibilidad de clase péptido-principal han sido una herramienta muy valiosa para estudiar las respuestas de células T CD8 +. Debido a que estos reactivos se unen directamente a receptores de células T en la superficie de las células CD8 + T-linfocitos, tetrámeros pMHC-I marcados con fluorocromos permiten la detección precisa de antígeno (Ag) + específicos de células T CD8 sin la necesidad de re in vitro -estímulo. Por otra parte, cuando se combina con multi-color de citometría de flujo, pMHC-I tinción tetrámero puede revelar aspectos clave de las células T CD8 + Ag-específicas, incluyendo etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación. Estos tipos de análisis han sido especialmente útiles en el campo de la inmunología del VIH en las células T CD8 + pueden afectar la progresión a SIDA. La infección experimental de macacos rhesus con virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) proporciona una valiosa herramienta para estudiar la inmunidad celular contra el virus del SIDA. Como resultado, progre considerabless se ha hecho en la definición y la caracterización de las respuestas de células T en este modelo animal. Aquí presentamos un protocolo optimizado para el recuento de células T SIV-CD8 + específicas en macacos rhesus por pMHC-I tinción tetrámero. Nuestro ensayo permite la cuantificación y la memoria simultánea fenotipificación de dos poblaciones de células T pMHC-I tetrámero + CD8 + por prueba, que podrían ser útiles para el seguimiento de las respuestas de SIV específicos de células T CD8 + generadas por vacunación o infección SIV. Teniendo en cuenta la relevancia de primates no humanos en la investigación biomédica, esta metodología es aplicable para el estudio de las respuestas de células T CD8 + en múltiples contextos de enfermedades.
Introduction
Las células T CD8 + comprenden un componente crucial del sistema inmune adaptativo ya que participan en la vigilancia inmune del tumor y contribuyen a la erradicación de patógenos intracelulares 1. En términos simples, las células T CD8 + expresan receptores de células T (TCR) que reconocen específicamente de histocompatibilidad de clase complejo de péptido-major I (pMHC-I) moléculas presentes en la membrana plasmática de las células huésped. Dado que estos péptidos se derivan de la proteólisis de las proteínas sintetizadas endógenamente, pMHC-I de la superficie celular complejos proporcionan una ventana en el medio ambiente intracelular. Tras la infección por el virus, por ejemplo, las células infectadas se mostrarán moléculas MHC-I que contienen péptidos derivados de virus que pueden servir como ligandos para los TCR expresadas por patrullando las células T CD8 +. En el caso de un CD8 + de células T específica del virus se encuentra con una célula infectada presentar su ligando pMHC-I, compromiso TCR resultará en la activación de células T CD8 + y ultiinstancia conducir a la lisis de las células diana. Dada la naturaleza crítica de estas interacciones TCR / pMHC-I, la determinación de la magnitud, la especificidad y el fenotipo de la respuesta de células T CD8 + a menudo puede revelar pistas importantes sobre las enfermedades humanas.
Hasta principios de 1990, la cuantificación de las células T CD8 + específicas de Ag-basó en el ensayo técnicamente exigentes dilución limitante (LDA) 2,3. No sólo se le requiere la LDA varios días para completarse, también se pudo detectar células que carecían de potencial proliferativo. Como resultado, la LDA enormemente subestimó la frecuencia real de las células T antígeno (Ag) específicos de CD8 + que participan en una respuesta inmune. Aunque el desarrollo de ELISPOT y ensayos de tinción intracelular de citoquinas mejora en gran medida la capacidad de medir la inmunidad celular, estos métodos aún requieren la estimulación in vitro para la cuantificación de células T específicas de Ag-4. No fue hasta 1996 que Altman, Davis, y coleagues publicaron su artículo de referencia informar el desarrollo de la tecnología de tetrámeros pMHC-I 5. Crítica para el éxito de esta técnica fue la multimerización de las moléculas pMHC-I, que se extendían la vida media de las interacciones TCR / pMHC-I, lo que reduce la probabilidad de tetrámeros pMHC-I que caen fuera durante las etapas de lavado de ensayos de citometría de flujo. La principal ventaja de tetrámeros pMHC-I en los ensayos mencionados anteriormente es la capacidad para detectar con precisión las células T Ag-CD8 + específicas directamente ex vivo sin la necesidad de re-estimulación in vitro en. Por otra parte, la combinación de pMHC-I tinción tetrámero con multi-color de citometría de flujo ha permitido un análisis detallado de la etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación de + células T CD8 específicas de Ag-2-4. A la luz de los recientes avances técnicos para la caracterización de los repertorios de células T CD8 + por pMHC-I tinción multímero 6, la amplitud de las aplicaciones for esta metodología es probable que continúe en expansión.
Pocas áreas de la investigación biomédica han beneficiado más de pMHC-I tinción tetrámero que el campo de la inmunología del VIH 7. A pesar de que las células T CD8 + se habían asociado temporalmente con el control inicial de la viremia del VIH en el momento de la publicación por Altman, Davis y sus colegas 8,9, el uso de tetrámeros pMHC-I en los años siguientes se expandió significativamente nuestra comprensión de el VIH-específica respuesta de células T CD8 +. Por ejemplo, pMHC-I tinción tetrámero ayudó a confirmar el tamaño robusta de las respuestas de células T específicas del virus CD8 + en la mayoría de las personas infectadas por el VIH 10-12. Esta metodología también facilitó la caracterización del VIH y las respuestas de células T CD8 + específicas SIV-restringidos por moléculas MHC-I asociados con el control de la replicación viral espontánea en ausencia de terapia antirretroviral, un fenómeno conocido como "control de la élite" <sup> 13-15. Además, tetrámeros pMHC-I fueron instrumental en el establecimiento del eje muerte programada de 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como vía reversible para el fenotipo disfuncional de + específicas del VIH CD8 células T en la infección crónica no controlada 16,17. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la utilidad de tetrámeros pMHC-I para el seguimiento de las respuestas de células T CD8 + contra el virus del SIDA.
La infección experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) sigue siendo el mejor modelo animal para la evaluación de las intervenciones inmunológicas contra el VIH / SIDA 18,19. En los últimos 25 años, se ha hecho un progreso sustancial en la identificación y caracterización de las células T SIV-CD8 + específicas en esta especie de monos, incluyendo el descubrimiento de alelos MHC-I y la definición de la unión de péptidos motivos 13,20-27 . Como resultado, tetrámeros pMHC-I se han desarrollado para el análisis de específica SIV + de células T CD8respuestas en este modelo animal 28. La mayoría de estos reactivos se hacen de los productos génicos de cuatro macacos rhesus alelos MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, y Mamu-B * 017: 01. Es de destacar que los macacos rhesus no expresan un locus MHC-C 29. La gran mayoría de los tetrámeros pMHC-I utilizados en los presentes experimentos se produjeron en el Centro de NIH tetrámero Núcleo de la Universidad Emory. Sin embargo, algunos de estos reactivos, incluyendo Mamu-A1 * 001 tetrámeros con destino a la inmuno epítopo Gag CM9, sólo puede obtenerse de fuentes comerciales, debido a los acuerdos de licencia. Utilizando tetrámeros pMHC-I de los cuatro alelos macacos rhesus enumerados anteriormente, hemos registrado con éxito las células T CD8 + contra un total de 21 epítopos SIV (Tabla 1), que fueron inducidos por la vacunación o infección primaria SIV 30,31 (Martins et al., observaciones no publicadas).
El presente manuscrito proporciona unaprotocolo de tinción de tetrámero optimizado pMHC-I para la determinación del fenotipo de frecuencia y la memoria de las células T CD8 + específicas de SIV en macacos rhesus. El ensayo comienza con una electiva 30 min de incubación con un inhibidor de la proteína quinasa (PKI; aquí, se utiliza dasatinib) con el fin de disminuir TCR internalización y con ello mejorar pMHC-I tetrámero tinción 32. Como se describe a continuación, este tratamiento es especialmente útil cuando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. También se proporcionan instrucciones sobre cómo marcar las células con tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromo y anticuerpos monoclonales (MAB). Este protocolo también incluye una etapa de permeabilización celular para la detección intracelular de la citolisis asociada molécula de granzima B (Gzm B). El mAb contra CD3 se añade en este paso también para mejorar la detección de esta molécula de señalización del TCR. Como referencia, se enumeran todos los fluorocromos utilizados en este panel de tinción.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pocos pasos de este procedimiento de discusión mérito ya que son cruciales para la obtención de resultados óptimos. En primer lugar, ya que la calidad de las muestras biológicas es un fuerte predictor del éxito de cualquier ensayo de citometría de flujo 38, todo se debe tener cuidado para asegurar que las células son viables y en suspensión durante el procedimiento de tinción. Esto es particularmente relevante cuando se trabaja con muestras crioconservadas ya que son más propensos a la formación…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a David Watkins para apoyar los experimentos que permitieron a la optimización de la metodología actual. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyado en parte por una subvención piloto proporcionada por el Centro de Miami para la Investigación del SIDA de los Institutos Nacionales de la Salud con el número P30AI073961 premio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
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