Analys av Simian Immunodeficiency Virus-specifika CD8<sup> +</sup> T-celler i rhesusmakaker av peptid-MHC-I tetramer färgning
Summary
Här presenterar vi en optimerad protokoll för att räkna och karakterisera Rhesusapa CD8 + T-celler mot AIDS-viruset. Den här artikeln är användbar inte bara till området för HIV immunologi, men även till andra delar av biomedicinsk forskning där CD8 + T-cellssvar är kända för att påverka sjukdoms resultatet.
Abstract
Peptid-MHC klass I (pMHC-I) tetramerer har varit ett ovärderligt verktyg för att studera CD8 + T-cellsvar. Eftersom dessa reagens direkt binda till T-cellreceptorer på ytan av CD8 + T-lymfocyter, fluorokrommärkta pMHC-I tetramerer möjliggöra noggrann detektering av antigen (Ag) -specifika CD8 + T-celler utan behovet av in vitro re -stimulering. Dessutom i kombination med flera färger flödescytometri kan pMHC-I tetramer färgning avslöja viktiga aspekter av Ag-specifika CD8 + T-celler, inklusive differentiering skede minne fenotyp och aktiveringsstatus. Dessa typer av analyser har varit särskilt användbar när det gäller HIV immunologi där CD8 + T-celler kan påverka utvecklingen till aids. Experimentell infektion av rhesusmakaker med simian immunbristvirus (SIV) ger ett ovärderligt verktyg för att studera cellulär immunitet mot AIDS-viruset. Som ett resultat, avse progress har gjorts när det gäller att definiera och karakterisera T-cellsvar i denna djurmodell. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att räkna upp SIV-specifika CD8 + T-celler i rhesusmakaker efter pMHC-I tetramer-färgning. Vår analys medger samtidig kvantifiering och minne fenotypning av två pMHC-I-tetramer + CD8 + T-cellpopulationer per test, vilket kan vara användbart för att spåra SIV-specifika CD8 + T-cellsvar som genereras av vaccination eller SIV-infektion. Med tanke på betydelsen av icke-mänskliga primater i biomedicinsk forskning, är denna metod tillämpas för att studera CD8 + T-cellsvar i miljöer flera sjukdomar.
Introduction
CD8 + T-celler innefattar en viktig del av det adaptiva immunsystemet som de deltar i tumörimmun övervakning och bidra till utrotningen av intracellulära patogener 1. I enkla termer, CD8 + T-celler uttrycker T-cellreceptorer (TCR) som specifikt känner igen peptid-MHC-klass I (pMHC-I) molekyler som är närvarande på plasmamembranet av värdceller. Eftersom dessa peptider härleds från proteolys av endogent syntetiserade proteiner på cellytan pMHC-I-komplex ge ett fönster in den intracellulära miljön. Vid virusinfektion, till exempel, kommer infekterade celler uppvisar MHC-I-molekyler som innehåller virushärledda peptider som kan fungera som ligander för TCR som uttrycks av patruller CD8 + -T-celler. I händelse av ett virus-specifika CD8 + T-cells påträffar en infekterad cell som presenterar dess pMHC-I-ligand, kommer TCR ingrepp resultera i CD8 + T-cellaktivering och ultiändan leda till målcellslys. Med tanke på den kritiska naturen av dessa TCR / pMHC-I-interaktioner, bestämma storleken, specificitet, och fenotyp att svara CD8 + T-celler kan ofta avslöja viktiga ledtrådar om mänskliga sjukdomar.
Fram till början av 1990-talet, kvantifiering av Ag-specifika CD8 + T-celler förlitat sig på den tekniskt krävande begränsande utspädning analys (LDA) 2,3. Inte bara LDA kräver flera dagar för att vara klar, det också misslyckats med att detektera celler som saknade proliferativ potential. Som ett resultat, LDA skattas vastly den verkliga frekvensen av antigen (Ag) -specifika CD8 + -T-celler som deltar i en immunrespons. Även om utvecklingen av ELISPOT och intracellulära cytokin färgnings analyser förbättrats kraftigt förmågan att mäta cellulär immunitet, dessa metoder fortfarande krävs stimulering in vitro för kvantifiering av Ag-specifika T-celler 4. Det var inte förrän 1996 som Altman, Davis, och colleagues publicerade sin milstolpe artikel rapporterar utvecklingen av pMHC-I tetramer teknik 5. Avgörande för framgången med denna teknik var multimerise av pMHC-I-molekyler, som förlängde halveringstiden för TCR / pMHC-I-interaktioner, vilket minskar sannolikheten för pMHC-I tetramerer faller bort under tvättningsstegen av flödescytometriska analyser. Den största fördelen med pMHC-I tetramerer över de tidigare nämnda analyser är förmågan att noggrant detektera Ag-specifika CD8 + T-celler direkt ex vivo utan att det behövs in vitro re-stimulering. Dessutom flöde kombinationen av pMHC-I tetramer färgning med flerfärgade cytometri har gjort detaljerade analyser av differentiering scenen, minne fenotyp och aktiveringsstatus av Ag-specifika CD8 + T-celler 2-4. Mot bakgrund av de senaste tekniska framstegen för karakterisering CD8 + T-cells repertoar pMHC-I multimer färgning 6, bredden av ansökningar for denna metod kommer sannolikt att fortsätta att expandera.
Få områden inom biomedicinsk forskning har gynnats mer från pMHC-I tetramer färgning än inom HIV immunologi 7. Även CD8 + T-celler hade tidsmässigt samband med den ursprungliga kontrollen av HIV viremi vid tidpunkten för offentliggörande av Altman, Davis och kollegor 8,9, användning av pMHC-I tetramerer i de följande åren väsentligt ökat vår förståelse av HIV-specifika CD8 + T-cellssvar. Till exempel, hjälpte pMHC-I tetramer färgning bekräftar den robusta storleken på virusspecifika CD8 + T-cellsvar i de flesta HIV-infekterade individer 10-12. Denna metod användes också för karakterisering av HIV och SIV-specifika CD8 + T-cellsvar begränsas av MHC-I-molekyler i samband med spontan kontroll av virusreplikation i frånvaro av antiretroviral terapi, ett fenomen som kallas "elit kontroll" <sup> 13-15. Vidare pMHC-I tetramerer bidrog upprättandet av programmerad celldöd en (PD-1) / PD-ligand 1 (PD-L1) axel som en reversibel väg för dysfunktionella fenotypen av HIV-specifika CD8 + T-celler i okontrollerad kronisk infektion 16,17. Tillsammans står dessa studier understryker användbarheten av pMHC-I tetramerer för övervakning av CD8 + T-cellsvar mot AIDS-viruset.
Experimentell SIV-infektion av rhesusmacaques (Macaca mulatta) är det bästa djurmodell för utvärdering av immun insatser mot hiv / aids 18,19. Under de senaste 25 åren har betydande framsteg gjorts när det gäller identifiering och karakterisering av SIV-specifika CD8 + T-celler i denna apa arter, däribland upptäckten av MHC-I-alleler och definitionen av peptidbindningsmotiv 13,20-27 . Som ett resultat har pMHC-I tetramerer utvecklats för analys av SIV-specifika CD8 + T-cellsvar i denna djurmodell 28. De flesta av dessa reagens är tillverkade av de genprodukter av fyra Rhesusapa MHC-I-alleler: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, och Mamu-B * 017: 01. Notera behöver rhesusmacaques inte uttrycka en MHC-C locus 29. De allra flesta av de pMHC-I tetramerer som används i de aktuella experimenten producerades vid NIH Tetramer Core Facility vid Emory University. Vissa av dessa reagens, inklusive Mamu-A1 * 001 tetramerer bundna till immun Gag CM9 epitop, kan endast erhållas från kommersiella källor på grund av licensavtal. Använda pMHC-I tetramerer av de fyra Rhesusapa alleler som anges ovan, har vi framgångsrikt uppräknade CD8 + T-celler mot totalt 21 SIV epitoper (tabell 1), som inducerades genom vaccination eller primär SIV-infektion 30,31 (Martins et al., opublicerade observationer).
Föreliggande manuskript tillhandahåller enoptimerad pMHC-I tetramer färgningsprotokollet för bestämning av frekvens och minnes fenotypen av SIV-specifika CD8 + -T-celler i rhesusmacaques. Analysen börjar med en valbar 30 min inkubation med en proteinkinashämmare (PKI, här, är Dasatinib används) för att minska TCR internalisering och därmed förbättra pMHC-I tetramer färgning 32. Som beskrivs nedan, är denna behandling särskilt användbart när man använder Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Instruktioner om hur du märka cellerna med fluorokromkonjugerade pMHC-I tetramerer och monoklonala antikroppar (mAb) finns också. Detta protokoll omfattar även en cell permeabilization steg för den intracellulära detektering av cytolys associerade molekylen granzym B (GZM B). MAb mot CD3 tillsätts vid detta steg samt att förbättra upptäckten av denna TCR signalmolekyl. Som referens, alla fluorokromer som används i denna färgning panel i listan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Några steg i denna procedur merit diskussion eftersom de är av avgörande betydelse för framställning av optimala resultat. Först, eftersom kvaliteten på de biologiska prover är en stark prediktor för framgång för varje flödescytometrisk analys 38, all vård måste vidtas för att säkerställa att cellerna är livskraftiga och i suspension under färgningsproceduren. Detta är särskilt relevant när man arbetar med kryokonserverade prover eftersom de är mer benägna att klumpar och innehåller t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka David Watkins för att stödja de experiment som gjorde det möjligt för optimering av den nuvarande metoden. Research rapporterade i denna publikation stöddes delvis av en pilotbidrag från Miami Centrum för AIDS-forskning av National Institutes of Health i tilldelning nummer P30AI073961. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
