Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi<sup> +</sup> Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin
Summary
Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.
Abstract
Peptit-büyük doku uygunluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tetramerler CD8 + T hücre yanıtlarını incelemek için paha biçilmez bir araç olmuştur. Bu reaktifler, doğrudan CD8 + T lenfositlerinin yüzeyinde bulunan, T-hücresi reseptörlerine bağlanan için, florokrom etiketli pMHC I tetramerleri antijenin doğru algılama (ag) 'in vitro yeniden gerek kalmadan-spesifik CD8 + T hücreleri etkinleştirmek -uyarım. Akım sitometri çoklu renk ile kombine Dahası, pMHC-I tetramer boyama farklılaşma aşamasında, bellek fenotip ve aktivasyon durumu da dahil olmak Ag-spesifik CD8 + T-hücrelerinin temel yönlerini, ortaya çıkarabilir. CD8 + T hücreleri AIDS'e ilerlemesini etkileyebilir nerede analizler bu tür HIV immünoloji alanında özellikle yararlı olmuştur. maymun bağışıklık yetersizliği virüsü ile rhesus makak (SIV) Deneysel enfeksiyonu AIDS virüsüne karşı hücresel bağışıklığı incelemek için paha biçilmez bir araç sağlar. Bunun bir sonucu olarak, önemli bir PROGREp, bu hayvan modelinde T hücre yanıtlarını tanımlanması ve karakterize yapılmıştır. Burada pMHC I tetramer boyama ile resus makaklarda SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin sayımı da optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bizim deney aşılama veya SIV enfeksiyonu ile üretilmiş SIV spesifik CD8 + T-hücresi yanıtları izlemek için yararlı olabilir, test başına iki pMHC I tetramer +, CD8 + T-hücre popülasyonları, eş zamanlı miktar ve bellek fenotiplendirilmesini mümkün kılar. Biyomedikal araştırmalarda insan olmayan primatlarda alaka göz önüne alındığında, bu yöntem, bir çok hastalık ayarları CD8 + T-hücresi yanıtları çalışmak için de geçerlidir.
Introduction
Bunlar tümör immün gözetim katılmak ve hücre içi patojenlere 1 eradikasyonu katkıda bulundukları için, CD8 + T-hücreleri, uyarlayıcı bağışıklık sisteminin önemli bir bileşen ihtiva eder. Basitçe, CD8 + T hücrelerinin konakçı hücrelerin plazma membranı üzerinde mevcut olan T-hücresi spesifik peptid ana histo-uyumluluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tanıyan reseptörleri (TCR'ler) molekülleri ifade eder. Bu peptitler endojen biçimde sentezlenmiş proteinlerin proteolizine türetilir için, hücre yüzeyi pMHC-I kompleksleri hücre içi ortamı bir pencere sağlar. Virüs enfeksiyonu üzerine, örneğin, enfekte olmuş hücreler, CD8 + T hücreleri tarafından ifade edilen devriye TCRler için ligandlar olarak görev yapabilir virüs türevli peptitler içeren MHC-I-molekülleri gösterir. Bir virüs spesifik CD8 + T-hücresi pMHC I ligandını sergileyen bir enfekte olmuş hücre ile karşılaştığında durumunda, TCR etkileşimi CD8 + T-hücresi aktivasyonu ve ulti neden olurkalıntılarından hücre parçalama hedef yol açar. CD8 + T hücrelerinin yanıt büyüklüğü, özgüllük ve fenotip belirlenmesi, bu TCR / pMHC-I etkileşimlerinin kritik doğası göz önüne alındığında genellikle insan hastalıkları ile ilgili önemli ipuçları ortaya çıkarabilir.
1990'ların başına kadar Ag-spesifik CD8 + T hücrelerinin sayılmasına teknik talep sınırlayıcı seyreltme yöntemi (LDA) 2,3 dayanıyordu. LDA birkaç gün gerek yoktu tamamlanması için değil sadece, aynı zamanda proliferatif potansiyeli yoksun hücreleri algılamak için başarısız oldu. Bunun bir sonucu olarak, LDA ölçüde bir bağışıklık tepkisi katılan antijen (Ag) e özgü CD8 + T-hücreleri gerçek sıklığını göz ardı. ELISPOT ve hücre içi sitokin boyama deneyleri geliştirilmesi büyük selüler bağışıklığın ölçülmesi yeteneği geliştirilmiş olmasına rağmen, bu yöntemler de Ag-spesifik T-hücrelerini 4 ölçülmesi için in vitro uyarımı için gerekli. 1996 Altman, Davis ve argo kadar değildieagues pMHC-I tetramer teknolojisinin 5 gelişimini raporlama dönüm noktası makale yayınladı. Bu tekniğin başarısı için kritik böylece akış sitometrik deneylerinin yıkama adımları sırasında düşen pMHC I tetramerleri olasılığını azaltır, TCR / pMHC I etkileşimlerinin yarı ömrü uzatılmış pMHC I moleküllerinin multimerizasyon oldu. Yukarıda belirtilen testlere göre pMHC I tetramerleri en önemli avantajı, doğru in vitro yeniden uyarımı için ihtiyaç olmaksızın doğrudan ex vivo Ag-spesifik CD8 + T-hücreleri tespit yeteneğidir. Ayrıca, çok renkli olan pMHC I tetramer boyama kombinasyonu sitometrisi farklılaşma aşamasında, bellek fenotip ve Ag-spesifik CD8 + T-hücreleri 2-4 aktivasyonu durumunun analizleri sağladı akış. CD8 + T hücre repertuar karakterize etmek için son teknik gelişmeler ışığında pMHC-I, uygulama genişliklerini fo 6 boyama multimerr Bu metodoloji genişleterek devam etmesi muhtemeldir.
Biyomedikal araştırmalarda birkaç alanları HIV immünoloji 7 alanından daha pMHC-ı tetramer boyama daha yararlanmıştır. CD8 + T hücreleri geçici olarak Altman, Davis ve arkadaşları 8,9 ile yayınlandığı zaman HIV viremi ilk kontrolü ile ilişkili olmasına rağmen, takip eden yıllarda pMHC-I tetramers kullanımı önemli ölçüde daha iyi anlamamızı sağlamıştır CD8 + T hücresi tepkisi HIV 'a özel. Örneğin, pMHC I tetramer boyaması çok HIV bulaşmış kişilerin 10-12'de virüse spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının sağlam boyutu teyit etmiştir. Bu yöntem, aynı zamanda "elit kontrol" olarak bilinen antiretroviral tedavi bir fenomendir yokluğunda viral replikasyon kendiliğinden kontrolü ile ilişkili MHC-I-molekülleri ile sınırlı HIV ve SIV spesifik CD8 + T-hücre yanıtlarının karakterizasyonu kolaylaştırmıştır <sup> 13-15. Ayrıca, pMHC I tetramerleri, kontrolsüz, kronik enfeksiyonun HIV spesifik CD8 + T hücrelerinin işlevsel fenotip için bir tersinir yol olarak programlı ölüm 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) ekseni kurmakta etkili olmuştur 16,17. Topluca, bu çalışmalar AİDS virüsüne karşı CD8 + T hücre yanıtlarını izlemek için pMHC-I tetramers yararını altını çizmektedir.
Rhesus makak (Maçaca mulatta) Deneysel SIV enfeksiyonu HIV / AIDS 18,19 karşı bağışıklık müdahalelerin değerlendirilmesi için en iyi hayvan modeli kalır. Son 25 yıl içinde, önemli bir gelişme MHC-I-allel keşfi ve peptit bağlama motifleri 13,20-27 tanımı da dahil olmak üzere, bu maymun türlerinin SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlanmıştır . Bunun bir sonucu olarak, pMHC I tetramerleri SIV spesifik CD8 + T hücre analizi için geliştirilmiştirBu hayvan modelinde 28 tepkileri. Mamu-A 1 * 002, Mamu-A 1 * 001: 01, Mamu-B * 008: bu reaktiflerin çoğu dört al yanaklı makak MHC-I-allel gen ürünlerinin yapılan 01 ve Mamu-B * 017: 01. Notun, rhesus makak bir MHC-C lokusu 29 ifade yoktur. Mevcut deneylerde kullanılan pMHC-I tetramers büyük çoğunluğu Emory Üniversitesi'nde NIH Tetramer Core Tesisleri'nde üretilmiştir. Bununla birlikte, immünodominant Gag CM9 epitopa bağlanan Mamu-A 1 * 001 tetramerler dahil olmak üzere bu reaktiflerin bazı, ancak genel lisans anlaşmalar, ticari kaynaklardan elde edilebilir. Dört al yanaklı makak allellerinin kullanılarak pMHC I tetramerleri başarılı aşılama veya primer SIV enfeksiyonu 30,31 (Martins ve arkadaşları tarafından indüklenmiştir 21 SIV epitopların (Tablo 1) 'in bir toplamı karşı CD8 + T hücreleri numaralandırılmış olan, yukarıda listelenen ark., yayınlanmamış gözlemler).
Mevcut el yazması bir sağlarRhesus macaque SIV spesifik CD8 + T hucrelerının frekansı ve bellek fenotip saptanması için optimize pMHC I tetramer boyaması protokolü. TCR içselleştirme azaltmak ve bu sayede pMHC-I 32 boyama tetramer artırmak için, tahlil, bir protein kinaz inhibitörü (burada Dasatinib kullanılan PKI) ile seçmeli 30 dakika kuluçkalama ile başlar. 01 tetramerleri: Aşağıda tarif edildiği gibi Mamu-B * 017 kullanıldığında, bu tedavi, özellikle yararlıdır. florokrom-konjuge pMHC-I tetramers ve monoklonal antikorlar (mAbs) ile hücrelerin etiketlemek için nasıl talimatlar da verilmektedir. Bu protokol, aynı zamanda sitoliz ilişkili bir molekül granzim B (Gzm B), hücre içi saptanması için bir hücre geçirimli hale adımını içerir. CD3'e karşı mAb Bu TCR sinyal molekülünün bulgulanmasını geliştirmek için de bu aşamada eklenir. Bir referans olarak, bu boyama panelinde kullanılan bütün fluorochromes listelenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu prosedür liyakat tartışma birkaç adım onlar iyi sonuçlar veren için çok önemli olduğu gibi. Biyolojik örneklerin kalitesi herhangi bir akış sitometrik tahlil 38 başarı güçlü bir belirleyicisi olduğundan Birincisi, tüm bakım hücreleri boyama işlemi sırasında canlı ve süspansiyonda olmasını sağlamak için alınmalıdır. Onlar topaklanma daha yatkındır ve genellikle ölü hücrelerden daha yüksek sayı içeren bu yana dondurulan örnekleri ile çalışırken bu özellikle ön…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mevcut metodoloji optimizasyonu etkin deneyler desteklemek için David Watkins teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası P30AI073961 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri AIDS Araştırma Miami Merkezi tarafından sağlanan bir pilot hibe kısmen desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
Riferimenti
- Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
- Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
