Aumento do tempo de recuperação e diminuição da Administração LPS para estudar o nervo vago Estimulação Mecanismos em respostas inflamatórias Limitada
Summary
Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.
Abstract
Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.
Introduction
A imunidade inata fornece uma primeira linha imediato de defesa contra infecções e doenças em uma ampla gama de organismos. Não só inicia a resposta imunitária primária para eliminar a ameaça, mas que também desempenha um papel central na activação e educar a imunidade adaptativa, que leva a cabo as respostas imunitárias secundárias em uma maneira específica para o agente patogénico. A inflamação é orquestrado por uma variedade de citocinas e quimiocinas, que por sua vez tem a capacidade para atrair outras culas imunitias para o local da infecção e para induzir os sinais cardinais da inflamação, tais como vermelhidão, inchaço, dor, perda de função e febre . A duração e a intensidade da inflamação depender de vários factores, mas resolver a inflamação e restaurar a homeostase é um passo crítico para evitar o aparecimento de doenças inflamatórias crónicas. Os avanços recentes no campo da neurociência e imunologia ter desvendado mecanismos neurais específicos com imenso potencial terapêutico para controlar inflamação tanto no sistema nervoso central e na periferia. Um destes mecanismos é a via colinérgica anti-inflamatória (PAC), também conhecido como o reflexo inflamatória, que é conduzido pelo sistema nervoso autónomo 4, 5.
está atualmente acredita-se que mediadores inflamatórios ativar nervos sensoriais e enviar sinais sobre o estado de inflamação no sistema nervoso central. Uma resposta reflexa é então activada através do nervo vago eferente. Um extenso estudo sobre os detalhes anatômicos da PAC revelou um modelo parassimpático-simpático composto por dois nervos, o nervo vago e nervo do baço, respectivamente 6. No PAC, o nervo vago eferente colinérgica activado termina no gânglio celíaco-mesentérica, resultando na activação do nervo esplénica adrenérgicos por um mecanismo ainda a ser exploradas. O nervo esplénica, assim activado, é conhecido por internovate em estreita proximidade com as células imunitárias na polpa branca, da zona marginal, e polpa vermelha do baço, o órgão principal e obrigatório da tampa 7, 8. Norepinefrina (NE) a partir das terminações nervosas esplénicas liga-se aos receptores adrenérgicos β 2 correspondentes expressas em linfócitos T esplénicos. Isto induz a libertação de colina-acetil-transferase (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que por sua vez activa os receptores nicotínicos de acetilcolina (a7 α7nACh) em macrófagos, limitando assim a produção de citoquinas e inflamação 2. Consequentemente, é agora claro que o sistema nervoso é capaz de regular a inflamação em tecidos periféricos e para restaurar a homeostase imune local.
Tal como o nome sugere da via, o sistema de ACh é de importância fundamental para o funcionamento desta via de regulação neuro-imunitário. Curiosamente, os mecanismos envolvidos na activação dePAC parecem ser diferentes na periferia e no sistema nervoso central. Embora a importância dos receptores nicotínicos (α7nAChR) no baço foi demonstrado anteriormente 9, os receptores muscarínicos (mAChR) são obrigatórios para a activação central da via 10, 11. Mais recentemente, a administração periférica de um agonista muscarico M1 de acção central significativamente suprimidos de soro e de tumor baço α factor de necrose (TNF) durante a endotoxemia letal de murino, uma acção que necessário nervo vago intacta e nervo esplénica de sinalização 12. Também demonstramos recentemente que os ratinhos que carecem de prostaglandina E 2 (PGE 2) não foram capazes de responder à estimulação do nervo vago e não regular negativamente a libertação induzida por LPS de citocinas no soro e no baço 3. Portanto, o PAC também pode ser regulada por outros que o principal Camin ACh sistemasay.
O nervo vago foi nomeado como tal por causa de seu curso errante no corpo, que inervam principais órgãos, incluindo o fígado, pulmão, baço, rins, intestino e 13. Considerando esta grande inervação e o efeito imunossupressor muito potente do nervo vago, o potencial terapêutico da PAC podem abranger uma vasta gama de condições inflamatórias. O nervo vago pode ser electricamente (ou mecanicamente) activado, com controlo sobre a tensão e a frequência, e contrariamente ao tratamento convencional, com nenhuma droga adicionada ao corpo. Estão actualmente em curso ensaios em pacientes reumáticos, por exemplo, para testar a importância clínica da VNS no tratamento da inflamação crónica 14. No total, a comunicação e regulação da inflamação neuro-imunitário estão actualmente sob investigação, a qual irá fornecer um tratamento alternativo possível para a terapia convencional. Portanto, a análise do nervo vago estimulaçãoefeito n nos diferentes órgãos inervados, mas também a caracterização do potencial de ação terapêutica em modelos animais de inflamação crônica, com certeza gostaria de dar perspectivas e esperança para novos potenciais alvos terapêuticos.
A metodologia original desenvolvido por Tracey e colegas 4 não poderia ser transposto para o nosso campo de pesquisa devido a superestimulação da resposta inflamatória (por uma dose letal de LPS) e um intervalo de tempo muito curto entre a activação PAC ea-out ler. No presente estudo, iremos apresentar as alterações feitas no protocolo original, comparar as duas metodologias diferentes sobre os níveis de citocinas, e realçar uma nova observação e oposta sobre o órgão alvo (do baço).
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde a sua descoberta no início de 2000, os mecanismos da PAC, foram exaustivamente estudados. Temos agora uma boa imagem da via, e em particular, o órgão-alvo, o baço, onde NE, as células T de memória, Ach, e macrófagos trabalho em equipa muito eficiente para regular negativamente a mediadores inflamatórios 2. Temos também recentemente publicada dados sobre a importância de um sistema funcional de prostaglandinas em ratinhos, em particular, de PGE 2, que é, obviamente, um …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years’ Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.
Materials
| Computer | Toshiba | – | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1000mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 |
Riferimenti
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