एक मात्रात्मक माइक्रो निराकरण परख के अनुकूलन

Summary

इस अध्ययन से एक का वर्णन इमेजिंग आधारित सूक्ष्म निराकरण परख वायरस के बीच प्रतिजनी संबंधों का विश्लेषण करने के लिए। प्रोटोकॉल एक flatbed स्कैनर को रोजगार और अनुमापन, अनुमापन quantitation, निराकरण, और निराकरण quantitation सहित चार कदम, है। परख वर्तमान घूम इन्फ्लूएंजा एक (H1N1) pdm09, एक (H3N2), और बी वायरस के साथ अच्छी तरह से काम करता है।

Abstract

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Introduction

माइक्रो निराकरण (MN) assays को निष्क्रिय करने एंटीबॉडी के quantitation के लिए और एंटीवायरल गतिविधियों के विषाणु विज्ञान में उपयोग किया जाता है। Hemagglutination निषेध के लिए एक विकल्प के रूप में (एचआई) assays, एम.एन. assays रिसेप्टर बाध्यकारी इन्फ्लूएंजा वायरस में की आत्मीयता परिवर्तन, जो जटिल हो सकता है एचआई की व्याख्या परिणाम ^1,2,3 से प्रभावित गैर प्रतिजनी प्रभाव को दूर कर सकते हैं। अभी हाल तक, सबसे एम.एन. assays cytopathic प्रभाव (सीपीई) या एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (एलिसा) ^4.5 पर आधारित थे। एम.एन. ध्यान केंद्रित करने और पट्टिका में कमी पर आधारित assays 1990 ^6,7,8 में विकसित किए गए। फलक कमी assays दिखाई सजीले टुकड़े गिनती संक्रामकता यों के लिए पर भरोसा करते हैं। हालांकि, दृश्य मायने रखता है केवल बड़े सजीले टुकड़े हैं कि मानव आंखों से ढूढने हैं कवर, भले ही सजीले टुकड़े के बहुमत छोटे और कई मौजूदा घूम वायरस के लिए अदृश्य हैं। यह अधूरा कवरेज परीक्षकों के बीच में और प्रयोगों के बीच महत्वपूर्ण बदलाव पैदा कर सकता है, मैं करने के लिए अग्रणीncomparable का परिणाम है। यह भी विधि का उपयोग करने के लिए जब कुछ वायरस एकल कक्षों या बहुत छोटे सजीले टुकड़े के निष्फल संक्रमण दिखाने के लिए असंभव है।

गरीबों की गिनती के संकल्प एक इमेजिंग आधारित प्रोटोकॉल के लागू होने से सुधार किया जा सकता है। प्रौद्योगिकी, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और उच्च throughput में प्रगति के साथ अच्छी तरह से प्लेट पाठकों संक्रमित कोशिकाओं ⁹ गिनती करने के लिए सटीक साधन प्रदान कर सकते हैं। एक ट्रांस-प्रबुद्ध माइक्रोस्कोप के तहत, संक्रमित कुछ मार्कर के साथ टैग कोशिकाओं उप सेलुलर संकल्प में उनके अवशोषण या प्रतिदीप्ति इसके विपरीत द्वारा देखे जा सकते हैं। एक नमूना तो एक कंप्यूटर स्क्रीन पर विश्लेषण किया जा सकता है।

दुर्भाग्य से, देखने के क्षेत्र में कमी के कारण, एक सौ से अधिक टाइल छवियों एक भी अच्छी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक हैं। 96 कुओं के साथ एक थाली का विश्लेषण और इमेजिंग के बारे में दस हजार छवियों के प्रसंस्करण की आवश्यकता होगी। इस तरह की एक श्रमसाध्य प्रक्रिया में समय लगता है और महंगा है, और संकल्प प्राप्त की पीढ़ी में हैएल वायरल संक्रमण की दिनचर्या लक्षण वर्णन के लिए अनावश्यक। एक सीमित बजट के साथ प्रयोगशालाओं पा सकते हैं कि एक flatbed स्कैनर के आसपास का निर्माण दृष्टिकोण एक लागत प्रभावी, उच्च throughput विकल्प प्रदान करता है।

इस पत्र में, हम एक बेहतर पट्टिका कमी एम.एन. परख वायरस की एक बड़ी संख्या के प्रतिजनी लक्षण वर्णन के लिए और मात्रात्मक एंटीवायरल गतिविधियों और निराकरण एंटीबॉडी को मापने के लिए उपयुक्त है कि वर्णन है। परख कई फायदे हैं: सबसे पहले, यह एक इमेजिंग आधारित परख कि, सेलुलर स्तर पर वायरस के संक्रमण को मापने के लिए पट्टिका आकार की परवाह किए बिना सक्षम है। एक अच्छी तरह से भीतर कुल संक्रमित कोशिका आबादी (आईसीपी) की गिनती बहुत पता लगाने संवेदनशीलता बढ़ जाती है, यह संभव कम संक्रामकता के साथ वायरस को चिह्नित करने के लिए कर रही है। दूसरे, एक अधिक सटीक मात्रात्मक अनुमापन इनपुट वायरस की मात्रा निर्धारित करने के निराकरण के लिए पहले शुरू की है। मात्रात्मक इनपुट वायरस काफी कम कर देता है Variaविभिन्न प्रयोगों और बीच tion प्रयोगशालाओं के बीच अधिक परिणाम तुलनीय बनाता है। तीसरा, निराकरण titers, छवियों का विश्लेषण करने के लिए तेजी से quantitation कर रही है और उपयोगकर्ता के अनुकूल द्वारा सीधे निर्धारित किया जा सकता है। अंत में, प्रोटोकॉल की आवश्यकता संकल्प और सटीकता के साथ एक लागत प्रभावी और उच्च throughput विकल्प प्रदान करता है। quantitation एक flatbed स्कैनर और नि: शुल्क डाटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पर आधारित है। पूरे सेटअप एक छोटा निशान है और सबसे प्रयोगशालाओं में तैनाती है।

इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल वायरस अनुमापन, अनुमापन quantitation, वायरस बेअसर, और निराकरण quantitation सहित चार प्रमुख कदम है, के होते हैं। वायरस अनुमापन तैयारी प्रयोग निर्धारित करता है कि इनपुट वायरस की राशि निराकरण में इस्तेमाल किया जा रहा है। एक अनुमापन के दौरान वायरल सांद्रता के एक नंबर एक 96 अच्छी तरह से थाली में सेल monolayers को लागू कर रहे हैं। संक्रमित कोशिकाओं तो धारा 2 वायरल Dilu में quantitated रहे हैंtion है कि 20% -85% का उत्पादन आईसीपी बदले में में इसी निराकरण के लिए इनपुट वायरस के रूप में लागू किया जाता है धारा 3 निराकरण प्रोटोकॉल का titers अनुभाग का उपयोग 4. प्रयोगों है कि इसके बाद ऊपर प्रोटोकॉल प्रतिनिधि परिणाम में प्रस्तुत कर रहे हैं मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। परख में इस तरह के एक (H1N1) pdm09, एक (H3N2), और बी वायरस के रूप में वर्तमान घूम इन्फ्लूएंजा वायरस, के अधिकांश के साथ पिछले दो वर्षों के दौरान अच्छी तरह से परीक्षण किया गया है। इन्फ्लूएंजा वायरस के लक्षण वर्णन के परिणाम जो परामर्श बैठक में कहा कि 2016 में दक्षिणी गोलार्ध और 2016-2017 में उत्तरी गोलार्ध में उपयोग के लिए फ्लू के टीके पर सिफारिशें दे दी है के लिए रिपोर्ट में शामिल थे।

Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल के लिए जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) मौसमी इन्फ्लूएंजा वायरस और संभावित महामारी इन्फ्लूएंजा वायरस के लिए बीएसएल 3 + के लिए बीएसएल 2 है। वायरल अनुमापन वायरल नियंत्रण (वीसी) के वायरल एकाग्रता फैसला करने के लिए एक निराकरण प्रयोग के अग्रिम में आवश्यक है। 1. वायरस अनुमापन नोट: (1) वायरल कमजोर पड़ने के साथ या तो पंक्तियों या स्तंभों (चित्रा 1) की व्यवस्था की जा सकती है: वायरस की संख्या और डुप्लिकेट की संख्या पर निर्भर करता है, एक अच्छी तरह से थाली निम्नलिखित लचीलापन के साथ स्थापित किया जा सकता है। प्रत्येक वायरस एक अलग पंक्ति / स्तंभ पर कब्जा करना चाहिए। (2) वायरल कमजोर पड़ने वेतन वृद्धि लचीला है, लेकिन यह शीर्ष बाएँ कोने पर उच्चतम वायरल एकाग्रता के साथ शुरू करना चाहिए। (3) डुप्लिकेट की संख्या पर कोई प्रतिबंध नहीं है। नोट: Madin डार्बी कुत्ते गुर्दा (MDCK) और MDCK-SIAT1 (SIAT) कोशिकाओं कृपया डा एम Matrosovich, मारबर्ग, जर्मनी द्वारा प्रदान किया गयाकई 10। SIAT कोशिकाओं MDCK कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक मानव सीएमपी-एन-acetylneuraminate साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं: सियालिक एसिड (एसए) के बढ़ाया अभिव्यक्ति के लिए बीटा galactoside α-2,6-sialyltransferase जीन α2-6Gal समाप्त oligosaccharides। अशेष पर्याप्त MDCK कोशिकाओं या MDCK-SIAT कोशिकाओं 8 96 अच्छी तरह प्लेटों में (/ अच्छी तरह से 200 μl)। कोशिकाओं संगम तक पहुंचने के लिए 2 या 3 दिन के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और एंटीबायोटिक दवाओं (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक DMEM में कोशिकाओं प्रचार। 5% सीओ 2 और 1 मिलीग्राम / एमएल G418 सल्फेट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर SIAT कोशिकाओं को सेते हैं। ध्यान दें: कमजोर पड़ने कारक अनुभव और सेल इस्तेमाल लाइन पर निर्भर है। सेल monolayer मिला हुआ होना चाहिए (यानी, कोई कोशिका दीवार या MDCK कोशिकाओं और MDCK-SIAT1 कोशिकाओं के लिए एक कसकर पैक लेआउट के लिए दिखाई दे रूपरेखा) वायरस टीका के समय में। dilutions के उदाहरण पर आधारितMDCK या MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का मिला हुआ बोतल के उपसंस्कृति तालिका 1 में दिया जाता है। कोशिकाओं को वायरस मध्यम विकास (VGM) अच्छी तरह से प्रति के 200 μl के साथ 3 बार धोएं। 30 मिनट के लिए 70% EtOH के साथ multiwall प्लेट वॉशर जीवाणुरहित, और फिर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या धोने से पहले VGM में यह कुल्ला। VGM Aspirate और तुरंत अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए VGM के 50 μl जोड़ें। (परीक्षण के वायरस और डुप्लिकेट की संख्या पर निर्भर करता है, या कम) 6 बाँझ ट्यूबों में से प्रत्येक को VGM के 900 μl जोड़ें। पहले ट्यूब में वायरस के 100 μl पिपेट, मिश्रण अच्छी तरह से, और क्रमानुसार पतला, प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच सुझावों का बदल रहा है। प्रत्येक वायरस के लिए दोहराएँ titrated किया जाना है। नोट: यह 10 -6 के लिए 10 -1 वायरस dilutions दे देंगे। उच्चतम कमजोर पड़ने से शुरू प्रत्येक वायरस के कमजोर पड़ने के 50 μl जोड़ें, (1 एक्स चित्रा 1 में 10 -5), एक 9 के दोहराया कुओं (कॉलम 9 और 10 चित्रा 1 में)6 अच्छी तरह से थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट में 2-3 घंटे के लिए जगह वायरस कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति है। नोट: एक 2 से 3 घंटा ऊष्मायन सुनिश्चित करने के लिए कि inoculum में वायरस monolayer तक पहुंचने के लिए पर्याप्त समय आवश्यक है। ओवरले तैयार (10 मिलीग्राम / प्लेट) नोट: ओवरले 2x DMEM, trypsin (2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता), सेल्यूलोज कपास linters के 5 मिलीलीटर (सामग्री की सूची देखें) 20 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर की μl, और के 5 मिलीलीटर के होते हैं। inoculum निकालें। ओवरले (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 200 μl) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं, अबाधित। नोट: वायरस नवोदित 4 घंटा लगभग बाद जगह लेता है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि प्लेट इस समय के बाद परेशान नहीं है। कुओं से ओवरले aspirate। पीबीएस एक में ठंडा 4% paraformaldehyde जोड़ें (200 μl / अच्छी तरह से)। 30 मिनट के लिए या 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें जगह है। नोट: पीबीएस एक 10 जाने के साथ प्राकृतिक पीएच फॉस्फेट बफर खारा हैएफ NaCl, KCl के 0.25 जी, ना 2 4 HPO की 1.437 जी, के.एच. 2 4 पीओ की 0.25 ग्राम, और आसुत जल के 1 एल (सामग्री की सूची देखें)। नोट: Paraformaldehyde हानिकारक जब साँस और अगर निगल जलता पैदा कर सकता है। वहाँ भी एक कैंसर प्रभाव के सीमित सबूत है, और यह त्वचा से संपर्क के बाद संवेदीकरण का कारण बन सकता है। (200 μl / अच्छी तरह से) paraformaldehyde Aspirate और पीबीएस के साथ दो बार एक प्लेटें धोने। भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस ए में प्लेटों की दुकान, या निम्न चरणों के साथ जारी रखो। permeabilization बफर जोड़ें (100 μl / अच्छी तरह से)। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। प्लेट पीबीएस एक साथ दो बार धोने (200 μl / अच्छी तरह से)। अच्छी तरह से प्रति,: (एलिसा बफर में 1,000 1) पहली एंटीबॉडी के 50 μl, इन्फ्लूएंजा प्रकार एक के खिलाफ माउस MAb जोड़ें। 1 घंटा (या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात) के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं, झटकों के साथ। धोने बफर (0.05% के बीच 80 में पीबीएस ए, वी / वी) पी के 100 μl में यह 3 बार धोएंएर अच्छी तरह से। washes के बीच 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, यह अच्छी तरह से प्रति 300 μl का उपयोग कर ऊष्मायन के बिना 3 बार धोएं। दूसरी एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें, बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + L) एचआरपी साधना (1: 1,000 एलिसा बफर में), प्रति अच्छी तरह से। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं, झटकों के साथ। यह 3 बार धोएं कदम 1.17 में वर्णित है। सब्सट्रेट (50 μl / अच्छी तरह से) जोड़ें। 30 मिनट के लिए या जब तक एक नीले रंग के विकास के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है कमरे के तापमान पर यह सेते हैं। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, अच्छी तरह से प्रति आसुत जल के 200 μl के साथ दो बार प्लेट धोने, washes के बीच 2 -3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubating। प्लेट हवा शुष्क और एक अंधेरी जगह (जैसे, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट) में संग्रहीत। 2. अनुमापन Quantitation एक flatbed स्कैनर की स्कैनिंग क्षेत्र में एक अच्छी तरह से थाली की जगह के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया है। करने के लिए एल आकार स्थिति सीमा उपयोग करेंएक इष्टतम और repeatable इमेजिंग स्थान सुनिश्चित करते हैं। नोट: यह एक स्कैन में छवि दो अच्छी तरह से प्लेटों के लिए संभव है। एक छवि स्कैन करें। नोट: सेटिंग्स तालिका 2 में दिखाया जाता है। "Wellplate रीडर" सॉफ्टवेयर की आवश्यकता वायरस एकाग्रता (चित्रा 3) की गणना करने के लिए चलाएँ। एक छवि लोड करने के लिए "लोड छवि" बटन पर क्लिक करें। नमूना सीमा समायोजित करने के लिए "ग्लोबल थ्रेसहोल्ड" टैब के हिस्टोग्राम में लाल पट्टी स्लाइड। छवि पर प्रभाव की जांच करने के लिए "अपडेट" बटन पर क्लिक करें। "गणना निराकरण / अनुमापन" बॉक्स को टिक करें। आईसीपी यों तो "नमूना" बटन पर क्लिक करें। जब प्रेरित नमूने के परिणाम को बचाने के लिए "सहेजें" बटन पर क्लिक करें। नोट: नमूना लेने की प्रक्रिया के बाद, एक नई विंडो "निराकरण और अनुमापन गणना" कहा जाता है स्वचालित रूप से प्रकट होता है, तो "गणना निराकरण / अनुमापन" बॉक्स ticked है। लोड या इनपुट अच्छी तरह से प्लेट परिभाषा नक्शा। सीमा (जैसे, 30%) ": इष्टतम वायरस जनसंख्या (%) अनुमापन" में संकेत मिलता है। अनुमापन परिणामों की गणना करने के लिए "अनुमापन प्रक्रिया" टैब का चयन करें। अनुमापन परिणामों की जाँच करें। अनुमापन परिणामों को बचाने के लिए 'सहेजें और बंद करें "बटन पर क्लिक करें। नोट: सॉफ्टवेयर के बारे में अधिक विस्तृत अनुदेश के लिए अनुपूरक एस 1 को देखें। पहले से शर्त सॉफ्टवेयर की एक प्रतिलिपि अनुरोध पर उपलब्ध है। नोट: आमतौर पर, प्रत्येक में अच्छी तरह से 11 के भीतर 50% (20-85%) कुल कोशिकाओं के चारों ओर आईसीपी पट्टिका में कमी परख पैदावार के लिए सबसे अच्छा वायरस कमजोर पड़ने। 3. वायरस निराकरण नोट: निराकरण परख के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या की गणना। प्रत्येक प्लेट एक वायरस और antisera की एक संख्या को समायोजित कर सकते हैं। नोट: antisera की संख्या और डुप्लिकेट की संख्या पर निर्भर करता है, एक अच्छी तरह से थाली वें के साथ सेट किया जा सकताई निम्नलिखित लचीलापन: (1) सीरम कमजोर पड़ने या तो पंक्ति या एक स्तंभ (चित्रा 4) के साथ व्यवस्थित किया जा सकता है। प्रत्येक सीरम एक अलग पंक्ति या स्तंभ पर कब्जा करना चाहिए। (2) सीरम कमजोर पड़ने की वेतन वृद्धि लचीला है, लेकिन यह एक प्लेट के ऊपर-बाएँ कोने पर उच्चतम सीरम एकाग्रता के साथ शुरू करना चाहिए। (3) डुप्लिकेट की संख्या antisera की संख्या संतुलन। अधिक डुप्लिकेट प्रयोगात्मक रूपों को सुचारू करने में मदद कर सकते हैं। (4) कुलपति की संख्या और सेल नियंत्रण (सीसी) डुप्लिकेट लचीला कर रहे हैं, लेकिन वे भी अलग पंक्तियों या स्तंभों में होना चाहिए की संख्या। यह उम्मीद है कि कुलपति डुप्लिकेट की संख्या antisera की तुलना में काफी अधिक है। के रूप में अग्रिम में 1.1-1.3, 2 या 3 दिन कदम, सेल monolayer तैयार करें। थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए VGM के 50 μl जोड़ें। क्रमश: 11 और 12 कॉलम का प्रयोग करें, कुलपति और सीसी के लिए। 01:20 रिसेप्टर को नष्ट करने एंजाइम (RDE) -treated सीरम के 50 μl aliquots Colum की पहली पंक्ति (ए) में जोड़ेएनएस 1-10। नोट: प्रत्येक वायरस और सीरम संयोजन के लिए, परख दो प्रतियों में किया जाता है, तो एक थाली, उदाहरण के लिए, एक वायरस पांच antisera के खिलाफ जांच हो सकती है। पंक्ति एच से 50 μl पंक्ति एक से 50 μl के हस्तांतरण (चित्रा 4 में कॉलम 1-10) एच पंक्ति को और discarding द्वारा धारावाहिक dilutions 2 गुना प्रदर्शन करना सीसी स्तंभ (चित्रा 4 में कॉलम 12) की एक अच्छी तरह से मंदक के 50 μl जोड़ें। सीसी स्तंभ के लिए छोड़कर, थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वायरस के 50 μl जोड़ें (कॉलम 1-11, चित्रा 4 में पंक्तियाँ एएच)। 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं। inoculum निकालें। प्रत्येक के लिए ओवरले (200 μl) अच्छी तरह से जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर यह सेते हैं, अबाधित। फिक्स और वायरस अनुमापन (कदम 1.11-1.22) के रूप में प्लेटों दाग। 4. निराकरण मात्रा एक flatbed स्कैनर की स्कैनिंग क्षेत्र में एक अच्छी तरह से थाली प्लेस, के रूप में दिखाया गया है figu2A रहे हैं। एल आकार स्थिति सीमा का उपयोग एक इष्टतम और repeatable इमेजिंग स्थान सुनिश्चित करने के लिए। नोट: यह एक स्कैन में छवि दो अच्छी तरह से प्लेटों के लिए संभव है। 2.2 कदम के रूप में वर्णित प्लेट स्कैन। "Wellplate रीडर" सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए आवश्यक वायरल titers (चित्रा 3, 2.3 कदम) की गणना करने के लिए। एक छवि लोड करने के लिए "लोड छवि" बटन पर क्लिक करें। "ग्लोबल सीमा" में लाल पट्टी स्लाइड नमूने सीमा को समायोजित करने के लिए। प्रभाव की जांच करने के लिए "अपडेट" बटन पर क्लिक करें। "गणना निराकरण / अनुमापन" बॉक्स को टिक करें। आईसीपी यों तो "नमूना" बटन पर क्लिक करें। जब प्रेरित नमूने के परिणाम को बचाने के लिए "सहेजें" बटन पर क्लिक करें। नोट: नमूना लेने की प्रक्रिया के बाद, एक नई विंडो "निराकरण और अनुमापन गणना" कहा जाता है स्वचालित रूप से प्रकट होता है, तो "गणना निराकरण / अनुमापन" बॉक्स ticked है। लोड या इनपुट अच्छी तरह-Pदेर नक्शा। सीमा (जैसे, 50%) में संकेत मिलता है "निराकरण:। संक्रमण कटौती (%)" titers की गणना करने के लिए "निराकरण प्रक्रिया" का चयन करें। titers चेक करें और निराकरण परिणामों को बचाने के लिए 'सहेजें और बंद करें "बटन पर क्लिक करें। नोट: निराकरण पूर्वनिर्धारित आईसीपी कमी (जैसे कि 50% या 80% के रूप में) कुलपति के खिलाफ (चित्रा 4 में कॉलम 11 का मतलब है) के साथ सीरम के उच्चतम कमजोर पड़ने के पारस्परिक रूप सूचना दी है। एक 50% कमी आईसीपी प्रतिनिधि परिणाम में इस्तेमाल किया गया था।

Representative Results

उपरोक्त प्रक्रिया के बाद, हम हाल ही में प्रतिजनी लक्षण वर्णन प्रयोगों से कुछ परिणाम प्रस्तुत करते हैं। अनुमापन सेटअप आठ इनपुट वायरस की जांच के लिए डिजाइन किया गया था, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए डबल डुप्लिकेट के साथ। वायरल dilutions परीक्षण किया गया 1.0 और -6 के बीच 10 x -1 1.0 x 1.0 वायरस के बीच बदलाव कवर करने के लिए। परीक्षण वायरस ए / कैमरून / 15V-3538/2015, सहित H3N2 उप प्रकार से थे ए / व्लादिवोस्तोक / 36/2015, ए / मास्को / 103/2015, ए / टॉम्स्क / 5/2015 /, ए / मास्को / 101 / 2015, ए / मास्को / 100/2015, ए / मास्को / 133/2015, और ए / Bratislava / 437/2015। अनुमापन परिणाम चित्रा 5 में सचित्र हैं। चित्रा 5 डी वायरस कमजोर पड़ने की वृद्धि के साथ आईसीपी की कमी को दर्शाता है। घटता ही वायरस है कि एक अच्छी तरह से 12 के भीतर सभी कोशिकाओं में संक्रमण झुकेंगे की आईसीपी के खिलाफ सामान्यीकृत थे (आईसीपी संतृप्ति के रूप में परिभाषित)। आईसीपी हाय के साथ संतृप्ति तक पहुँच नहीं था, तोghest वायरस एकाग्रता, इसी डुप्लिकेट से आईसीपी औसत बजाय इस्तेमाल किया गया था (ए / मास्को / 103 /, 2015 चित्रा 5 डी में)। वायरस dilutions कि आईसीपी संतृप्ति के 30% का उत्पादन निराकरण (3 टेबल) के लिए इनपुट वायरस कमजोर पड़ने के रूप में चुने गए हैं। निराकरण, पांच antisera के खिलाफ एक इनपुट वायरस है करने के उद्देश्य से प्रत्येक थाली पर डबल डुप्लिकेट के साथ। संदर्भ से पता चला वायरस H3N2 ए / स्टॉकहोम / 63/2015। पांच antisera हैं ए / एच 4801/14 अंडे F12 / 15, ए / एच 7295/14 MDCK F02 / 15, ए / दक्षिण अफ्रीका R2665 / 15 SIAT F50 / 15, ए / 9715923/13 स्विस SIAT NIBF F18 / 15, और ए / डच 525/14 SIAT F23 / 15। निराकरण परिणाम चित्रा 6 में सचित्र हैं। चित्रा 6D सीरम कमजोर पड़ने की वृद्धि के साथ संक्रमण प्रगति को दर्शाता है। ऊर्ध्वाधर अक्ष पर सामान्यीकृत सकारात्मक आबादी औसत आईसीपी के खिलाफ इसी antisera प्रतिक्रिया से आईसीपी के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता हैसंदर्भ वायरस 12 के। असंक्रमित सेल नियंत्रण से पृष्ठभूमि आईसीपी सामान्य बनाने के दौरान घटाया गया था। निराकरण titers 50% आईसीपी कमी (तालिका 4) के लिए इसी सीरमरोधी dilutions के reciprocals के रूप में निर्धारित किया गया है। रैखिक प्रक्षेप दो आसन्न सीरम dilutions के बीच गिरने titers अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 1: एक वायरस अनुमापन प्रयोग में एक अच्छी तरह से प्लेट सेटअप का उदाहरण है। टेस्ट वायरस अलग पंक्तियों (एच ए) को सौंपा है। कॉलम अलग वायरल dilutions (12 के लिए 1) के लिए तैयार कर रहे हैं। दो कॉलम प्रत्येक वायरल कमजोर पड़ने के लिए डुप्लिकेट के रूप में इस्तेमाल किया गया। स्केल बार = 10 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="jove_content" fo:keeपी-together.within-पेज = "1"> चित्रा 2: एक नमूना स्कैनिंग प्रणाली के Schematics। (क) एक flatbed स्कैनर की इमेजिंग स्थिति पर एक 96 अच्छी तरह से थाली (से पुनर्प्रकाशित Elsevier बी.वी. से अनुमति) के साथ संदर्भित 11, और (ख) एल आकार स्थिति सीमा के आयामों में दिखाया गया है (क)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3: "Wellplate रीडर" quantitation सॉफ्टवेयर के डेस्कटॉप आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </p> चित्रा 4: एक निराकरण प्रयोग में एक अच्छी तरह से प्लेट सेटअप का उदाहरण है। प्रत्येक सीरमरोधी डुप्लिकेट (1 से 10) के साथ दो स्तंभों के लिए सौंपा है। पंक्तियाँ अलग सीरम dilutions (एच ए) के लिए तैयार कर रहे हैं। वायरस नियंत्रण आठ डुप्लिकेट (H11 के लिए A11) के साथ 11 कॉलम लेता है। सेल नियंत्रण आठ डुप्लिकेट (H12 के लिए A12) के साथ कॉलम 12 में है। स्केल बार = 10 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5: एक अनुमापन प्रयोग के परिणाम। (क) में अच्छी तरह से थाली सेटअप, (ख) स्कैन अच्छी तरह से थाली छवि, (ग) का चित्रणरंग-इनकोडिंग, quantitated, वायरस से संक्रमित सेल की आबादी, और (घ) सामान्यीकृत वायरस से संक्रमित वायरस dilutions के खिलाफ सेल आबादी की। 30% आईसीपी सीमा के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (घ) त्रुटि सलाखों नमूना दोहराव (± 1 एसडी) से मानक विचलन (एसडी) कर रहे हैं। (ख) और (ग) स्केल सलाखों 10 मिमी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 6: एक निराकरण प्रयोग के परिणाम। (क) में अच्छी तरह से थाली सेटअप, (ख) अच्छी तरह से थाली छवि, (ग) quantitated, वायरस से संक्रमित कोशिका जनसंख्या का चित्रण, और (घ) सामान्यीकृत वायरस से संक्रमित सीरम कमजोर पड़ने के खिलाफ सेल की आबादी स्कैन कर है। इनपुट VIरस (वीसी) ए / स्टॉकहोम / 63/2015। 50% आईसीपी titers की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (घ) त्रुटि सलाखों नमूना दोहराव (± 1 एसडी) से मानक विचलन (एसडी) कर रहे हैं। (ख) और (ग) स्केल सलाखों 10 मिमी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। पूरक एस 1: इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। ठेठ कमजोर पड़ने MDCK कोशिकाओं MDCK-SIAT1 कोशिकाओं दो दिन 1: 5 (1 + 4) 1:10 (1 + 9) 3 दिन </td> 1:10 (1 + 9) 1:20 (1 + 19) मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की विशिष्ट नंबर MDCK कोशिकाओं MDCK-SIAT1 कोशिकाओं दो दिन 2 एक्स 10 5 1 एक्स 10 5 3 दिन 1 एक्स 10 5 5 एक्स 10 4 तालिका 1: MDCK या MDCK-SIAT1 कोशिकाओं का मिला हुआ बोतल का एक उपसंस्कृति पर ठेठ dilutions। मोड व्यावसायिक मोड दस्तावेज़ का प्रकार फिल्म (फिल्म क्षेत्र गाइड के साथ) ऑटो एक्सपोजर प्रकार तस्वीर मैं हूँउम्र के प्रकार 24 बिट रंग संकल्प 1,200 डीपीआई बचाया छवि प्रारूप झगड़ा तालिका 2: एक flatbed स्कैनर की विशिष्ट सेटअप। पंक्ति वाइरस अनुशंसित कमजोर पड़ने ए ए / कैमरून / 15V-3538/2016 और अधिक पढ़ें 1.0 एक्स 10 -2 बी ए / व्लादिवोस्तोक / 36 /, 2015 1.0 x 10 -3 सी ए / मास्को / 103/2015 1.1 x 10 -1 डी ए / टॉम्स्क / 5 /, 2015 5.9 x 10 -1 ए ए / मास्को / 101/2015 8.3 x 10 -1 एफ ए / मास्को / 100/2015 1.4 एक्स 10 -2 जी ए / मास्को / 133/2015 1.3 एक्स 10 -2 एच ए / Bratislava / 437/2015 1.3 x 10 -4 तालिका 3: वायरल dilutions गणना 30% आईसीपी की आबादी से। स्तंभ antisera अनुशंसित अनुमापांक 1 – 2 ए / HK4801 / 2014 110 3 – 4 ए / HK7295 / 2014 213.3 <td> 5 – 6 ए / दक्षिण अफ्रीका / R2665 / 2015 2155.8 7 – 8 ए / स्विट्जरलैंड / 9715293/2013 89.4 9 – 10 ए / नीदरलैंड्स / 525/2014 78.6 सारणी 4: ए / स्टॉकहोम के 50% आईसीपी / 63 /, 2015 antisera के खिलाफ कम से titers।

Discussion

इस अध्ययन में, हम वायरस के बीच सच्चा प्रतिजनी रिश्तों को यों तो एक इमेजिंग आधारित एम.एन. परख का वर्णन किया। अन्य पट्टिका में कमी assays के साथ तुलना में, विधि एक पूरे अच्छी तरह से आईसीपी मापने जोर देती है, संक्रामक आबादी की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने। पट्टिका गठन की अपनी स्वतंत्रता भी वायरस है कि मुख्य रूप से अदृश्य छोटे सजीले टुकड़े के रूप में कर सकते हैं या कि केवल एकल कोशिका के संक्रमण का प्रबंधन कर सकते करने के लिए परख के आवेदन चौड़ी। इसलिए, परख अधिक वायरस और एचआई से एंटीबॉडी का एक व्यापक रेंज के प्रभाव की जांच करने में सक्षम है, और इसे और अधिक व्यापक प्रतिजनी समानता या वायरस ^{12 के} बीच मतभेदों को प्रतिबिंबित करने के लिए मदद करता है। उदाहरण के लिए, जब oseltamivir कार्बोक्सिलेट शामिल किया गया है, एम.एन. परख कम NA-निर्भर से बाध्यकारी प्रभावित है, प्रतिजनी मतभेदों को दर्शाती है और अधिक सही। परख के विकास के दौरान, महान प्रयासों प्रयोग स्थिरता, गति, और पता लगाने को बढ़ाने के लिए किए गए थेसंवेदनशीलता, एक flatbed स्कैनर के साथ उच्च throughput में quantitated अनुमापन, इमेजिंग के माध्यम से इनपुट वायरस को नियंत्रित करने से सहित, और एक उपयोगकर्ता के अनुकूल डाटा प्रोसेसिंग मंच को लागू करने। परिणाम आम तौर पर संगत के साथ किया गया है और एचआई के उन लोगों की पुष्टि की है। विशेष रूप से, परिणाम भी इस तरह के कुछ एक (H1N1) pdm09 वायरस के HA1 में G155E प्रतिस्थापन के रूप में हाल ही में ग्रुप ए और बी के टीके वायरस के प्रतिजनी बहाव वेरिएंट के बीच मतभेद प्रतिजनी, साथ ही प्रतिजनी परिवर्तन संस्कृति से चयनित या छिटपुट परिवर्तन की वजह से, पता चला ^12।

प्रोटोकॉल सेल लाइनों है कि मजबूत संक्रमण है, जो बहुत इमेजिंग संकेत बढ़ाया दिया के चयन के साथ वायरस प्रकार या उपप्रकार मिलान नहीं हुआ। प्रयोगात्मक भिन्नता डुप्लिकेट की डिजाइन है कि परीक्षण किया antisera की संख्या के साथ संतुलित साथ smoothed किया गया था। अनिश्चितताओं भी छवि गुणवत्ता है, जो मुख्य रूप से इमेजिंग डिवाइस से प्रभावित है से आ सकता है। एक सभ्य रंग flatbed स्कैनर signi कर सकते हैंficantly छवि के विपरीत में सुधार लाने और शोर को कम। निराकरण में इनपुट वायरस की राशि मात्रात्मक इसी अनुमापन से अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए, जबकि वायरस अभी भी एक इसी तरह की स्थिति बनाए रखने के। निराकरण के दौरान, एक संक्रमण के सीरमरोधी प्रतिक्रिया संदर्भ वायरस (वीसी) और पृष्ठभूमि स्तर (सीसी) के बीच के अंतर के खिलाफ सामान्यीकृत है। कुलपति और सीसी की सटीक मापन एक निराकरण प्रयोग करने के लिए आवश्यक हैं। अधिक डुप्लिकेट सिफारिश कर रहे हैं (आठ डुप्लिकेट प्रतिनिधि परिणाम में इस्तेमाल किया गया)। अंत में, सॉफ्टवेयर को समझने के लिए एक प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। सॉफ्टवेयर दो से अधिक वर्षों के लिए डब्ल्यूएचओ इन्फ्लुएंजा केंद्र, ब्रिटेन में नियमित वायरस के लक्षण वर्णन के लिए परीक्षण किया गया है। विभिन्न स्थितियों से निपटने के लिए विस्तृत निर्देश पूरक एस 1 में प्रदान की जाती है।

यह एम.एन. परख आवेदन कहाँ नमूने एक ext कवर के लिए उपयुक्त हैदेखने के remely बड़े क्षेत्र लेकिन केवल मध्यम इमेजिंग संकल्प की आवश्यकता होती है। कम लागत और सरल स्थापना के सिस्टम को आसानी से सबसे विषाणु विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध है। एक ही नमूने के माप में भिन्नता 3% से कम है, जो मोटे तौर पर अनिश्चितता स्कैनिंग ¹¹ के दौरान पेश परिभाषित करता था। इस तरह के कई reproducibility विषाणुजनित अध्ययन में पर्याप्त है और आगे कई स्कैन से छवियों के औसत से कम किया जा सकता है।

अंत में, इस अध्ययन के एक मजबूत एम.एन. परख है कि नियमित प्रतिजनी अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है और वर्तमान में इन्फ्लूएंजा वायरस-घूम, विशेष रूप से मानव इन्फ्लूएंजा टीकों में शामिल करने के लिए वायरस के चयन के लिए साल में दो बार के विस्तृत विश्लेषण में HI डेटा का समर्थन करने के लिए यह दर्शाता है।

Materials

VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb
PBS A			Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L.
Avicell	FMC	RC-581F	2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.
2XDMEM	Gibco	21935-028
Trypsin	Sigma	T1426
Overlay (10ml/plate):			5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell  – 5ml
Triton X- 100e	Sigma	T8787	Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)
Tween 80	Sigma	P5188	Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v)
Horse serum	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA Buffer: 10%  in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
Mouse MAb against influenza type A	Biorad	MCA 400	1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate	Biorad	172-1011	2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
True Blu peroxidase substrate	KPL	50-78-02	Substrate:  True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)
96-well flat-bottom microtitre plates	Costar	3596
8 channel multiwall-plate washer and manifold	Sigma	M2656
Perfection Plate Scanner	Epson	V750 Pro	The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads.
Software operational environment: LabVIEW	National Instruments Corporation	Window based with NI Vision builder	Version: LabVIEW2012 or above