Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em> In Situ</em> Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In – situ – Proximity Ligation Assay Inositol – 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D – Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) nicht unabhängig sind Organellen in der Zelle, aber sie interagieren strukturell und funktionell an Kontaktstellen definiert als Mitochondrien-assoziierte endoplasmatischen Retikulum Membranen (MAM). Tatsächlich entsprechen MAMs zu Regionen, in denen die Membranen des ER und Mitochondrien eng angelagert werden, so dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen von beiden Seiten. Dennoch verschmelzen die Membranen dieser Organellen nicht innerhalb dieser Regionen, so behalten sie ihre separate Einheiten. Die MAMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Calcium (Ca ²⁺⁾ und Phospholipid Transfer von ER zu den Mitochondrien, den Energiestoffwechsel und das Überleben der Zellen ^1-3 zu beeinträchtigen.

Die Assoziation zwischen dem ER und Mitochondrien wurde zuerst in den 1970er Jahren mit der Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Seitdem Transmissionselektronenmikroskopie ^4,5, Elektronentomographie ^6,7 oder Immuno-Lokalisierung von ER und Mitochondrien-spezifischen Fluorophores / fluoreszierende Proteine ⁸ wurden klassisch zu studieren ER-Mitochondrien – Wechselwirkungen. Ein weiteres nützliches Werkzeug für die Analyse von MAM auf der Verwendung von subzellulären Fraktionierung basiert. Es erlaubt die Isolierung von MAM Fraktionen durch Differential Ultrazentrifugation gekoppelt mit einem Percollgradienten ^9. Allerdings enthält das Endprodukt angereichert MAM Fraktionen, anstatt reinen Fraktionen. Insgesamt sind diese Strategien nicht besonders empfindlich und / oder quantitative, und sie sind nicht leicht zugänglich für große Screening. Alternativ haben genetische Ansätze unter Verwendung von arzneimittel induzierbaren fluoreszierendes inter-Organell Linkern entstanden, aber sie haben nicht die Analyse von Organell Wechselwirkungen an den endogenen Expressionsniveaus von ¹⁰ Proteinen ermöglichen.

Basierend auf Szabadkai Entdeckung des IP3R / Grp75 / VDAC Komplex im MAM ¹¹ entwickelten wir eine quantitative Methode ER-Mitochondrien – Interaktionen zu analysieren. Wir haben die in situ Nähe ligatiauf Assay Wechselwirkungen zwischen VDAC1 und IP3R1 zwei Organell-Oberflächenproteine im Ca ²⁺ -channeling Komplex an der Grenzfläche MAM in fixierten Zellen ¹² beteiligt zu detektieren und zu quantifizieren. Kurz gesagt, sondiert wir VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran (Maus – anti-VDAC1 primärer Antikörper) und IP3R1 an der ER – Membran (Kaninchen – anti-IP3R1 primärer Antikörper) (Abbildung 1, Tafel A). Dann wird gemäß dem Test haben wir sowohl anti-Maus- und anti-Kaninchen-IgG (Maus und Kaninchen Proximity Ligation Assay-Sonden), die an komplementäre Oligonukleotid Erweiterungen konjugiert sind. Wenn die beiden Proteine gezielt in einem Abstand von weniger als 40 nm sind, können die Oligonukleotide mit den anschließend zugegeben Verbinder Oligos hybridisieren die Bildung einer kreisförmigen DNA – Templat (1, Feld B) zu ermöglichen. Diese kreisförmige DNA – Molekül ligiert und amplifiziert, eine einzelsträngige DNA – Produkt kovalent an einer der Näherungssensoren zu schaffen (Abbildung 1, Tafel c) </strong>. Da der Abstand zwischen dem ER und Mitochondrien im MAM – Schnittstelle im Bereich von 10 nm bis 25 nm ^6, Proximity Ligation und Amplifikation kann durchgeführt werden, aufgrund der Hybridisierung von Texasrot-markierten Oligonukleotidsonden zum anschließenden Nachweis führen (Abbildung 1, Tafel d ). Jeder fluoreszierenden Punkt repräsentiert Wechselwirkungen zwischen VDAC1 / IP3R1, so dass die Quantifizierung der di – situ – ER-Mitochondrien – Wechselwirkungen in einzelnen Zellen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Detektion von endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien Wechselwirkungen von In Situ Proximity Ligation Assay. a) Antikörpers Eine Maus primären gegen VDAC1 und ein Kaninchen primären Antikörper gerichtet gegen IP3R1 an ihre Epitope in der Nähe an der Schnittstelle MAM binden kann, b) die Zugabe eines Paares von Annäherungs Ligierung Sondengegen Maus und Kaninchen-IgG. Diese Sonden wurden DNA-Stränge befestigt, die Vorlagen für die Unterbindung des Steckers Oligos bilden können. c) Die kreisförmige DNA – Strang nach Ligatur gebildet wird, kann verstärkt und d) durch Mikroskopie als fluoreszierender Punkt unter Verwendung Texas rot-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ähnliche in situ Proximity Ligation Assay Experimente können mit dem Grp75 / IP3R1 Paar von Antikörpern sowie Cyclophilin D (CypD) / IP3R1 Antikörper durchgeführt werden, wenn man bedenkt , dass CypD wurde an der MAM Schnittstelle mit dem IP3R / Grp75 / VDAC – Komplex interagieren gezeigt ^14.12.

Protocol

1. Herstellung der Lösungen Herstellung von 10% Formaldehyd in PBS (low-Salz) von 5,5 ml 37% Formaldehyd in 14,5 ml PBS verdünnt. Vorbereitung 1 M Glycin, pH 8,0, die durch Auflösen von 3,8 g Glycin in 50 ml PBS; verdünnt diese Lösung 100 mM Glycin in 1x PBS zu erhalten. Bereiten 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereiten Sie 20x Saline Sodium Citrate (SSC) unter Verwendung von 3,0 M Natriumchlorid und 0,30 M Trinatriumcitrat in einem VE-Wasser-Puffer mit pH 7,0 bei 25 ° C. Verdünnen Sie diesen Puf…

Representative Results

Basierend auf unserer Erfahrung dieses Protokoll verwenden, können wir diese Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen sicher zu empfehlen. Repräsentative Bilder von in situ Proximity Ligation Assay-visualisierten ER-Mitochondrien – Wechselwirkungen in der HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie unter Verwendung von mehreren Paaren von Antikörpern, gezeigt. Wie in Figur 2 durch Fluoreszenzmikroskopie gezei…

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Materials

Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html