Протокол по использованию Ферстер Resonance Energy Transfer (FRET) -Force биосенсоров для измерения механических сил по всему комплексу ядерного ЛИНКА
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Чувствительная к Силе, генетически кодируемые сенсоры FRET недавно появились в качестве важного инструмента для измерения растяжения на основе силы в живых клетках, обеспечивая понимание того , как механические силы прикладываются белки 1, 2, 3, 4. С помощью этих инструментов, исследователи могут неинвазивно изображения внутриклеточных сил в живых клетках с помощью обычных флуоресцентных микроскопов. Эти датчики состоят из FRET-пары (донорные и акцепторные флуоресцентных белков, наиболее часто синий донор и желтый акцептор) , разделенная упругого пептидом 3. В отличии от С- или N-концевого мечения, этот датчик вставлен во внутреннем сайт белка для измерения механической силы, передаваемой через белок, ведет себя как датчик молекулярной деформации. Повышение механических напряжений через результаты датчика к увеличению расстояния между FRET-рвоздух, что приводит к снижению FRET 3. В результате лада обратно пропорциональна растягивающей силы.
Эти флуоресцентные основой датчики были разработаны для координационных белков адгезии (винкулины 3 и талины 4), белков цитоскелета (α-актинин 5), и клетка-клетка соединительных белков (Е-кадгерин 6, 7, VE-кадгерин 8 и РЕСЫ 8). Наиболее часто используемый и хорошо характеризуются упругий линкер в этих биосенсорах известен как TSmod и состоит из повторяющихся последовательности из 40 аминокислот, (GPGGA) 8, который был получен из паука шелка белка жгутовидного. TSmod было показано, ведет себя как линейная упругую нано-пружину, с FRET отзывчивостью к 1 до 5 пН растягивающего усилия 3. Различные длины жгутовидного могут быть использованы для изменения динамического гАнж из TSmod FRET силы чувствительности 9. В дополнении к жгутовидному, спектрин повторяет 5 и виллина заставку пептид (известный как HP35) 4 были использован в качестве эластичных пептидов между FRET-паром в аналогичных силовых биосенсорах 4. Наконец, недавний отчет показал , что TSmod также может быть использована для обнаружения сжимающих сил 10.
Недавно мы разработали датчик силы для линкера-цитоскелета ядерно (ЛИНК) сложный белок Nesprin2G с помощью TSmod вставляется в ранее разработанном усеченный белок Nesprin2G известного как мини-Nesprin2G (рис 2С), которая ведет себя так же , как эндогенные Nesprin-2G 11. Комплекс ЛИНКА содержит множество белков, которые ведут от наружного к внутренней части ядра, связывая цитоплазматические цитосколют к ядерной пластинке. Nesprin-2G представляет собой структурный белок связывания с какактина цитоскелета в цитоплазме и SUN белки в перинуклеарном пространстве. Используя наш биосенсор, мы смогли показать , что Nesprin-2G подлежит актомиозиновую-зависимую напряженность в NIH3T3 фибробластах 2. Это был первый раз, когда сила измеряется непосредственно через белок в комплексе ядерного ЛИНКА, и это, вероятно, станет важным инструментом для понимания роли силы на ядре в mechanobiology.
Протокол ниже приводится подробная методикой, как использовать датчик силы Nesprin-2G, в том числе экспрессии датчика натяжения Nesprin (Nesprin-TS) в клетках млекопитающих, а также сбора и анализа FRET изображений клеток, экспрессирующих Nesprin- TS. Используя перевернутую конфокальной микроскопии, оснащенный детектором спектрального, описание того, как измерить сенсибилизированные излучение FRET с использованием спектральной расслоении и обеспечивается ратиометрический FRET изображений. Выходные логометрических изображения могут быть использованы для относительного кваntitative сила сравнения. Хотя этот протокол ориентирован на экспрессию Nesprin-TS в фибробластах, он легко адаптируется к другим клеткам млекопитающих, в том числе обеих клеточных линий и первичных клеток. Кроме того, этот протокол, как он относится к приобретению и анализу изображений FRET может быть легко адаптирован к другим силе биосенсоров на основе FRET, которые были разработаны для других белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ и демонстрация клеток живого изображения от механического напряжения через Nesprin-2G, белок в комплексе ядерного ЛИНКА, были описаны выше. До этой работы, различные методы, такие как микропипетки аспирации, магнитно-бусинки цитометрии, и микроскопического лазерной абляции, были ис?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Томасом Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Memoria Trust (к DEC) и NIH грант R35GM119617 (для DEC). Конфокальный микроскоп визуализация была выполнена в VCU наноматериалы Характеристика Ядро (НКК) фонда.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
Riferimenti
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
