ACT-المعزوفة: المقاصة الأنسجة البيولوجية وطرق Immunolabeling للتصوير حجم

Summary

ACT-المعزوفة (نشط الوضوح تقنية ضغط المتعلقة نقل فعال ومستقر من الجزيئات في الأجهزة) يمكن إزالة الأنسجة سريعة وفعالة وغير مكلفة ولكن واختراق الأجسام المضادة السريع إلى أنسجة مسح عن طريق الانتشار السلبي أو تسليم بمساعدة الضغط. باستخدام هذه الطريقة، مجموعة واسعة من الأنسجة يمكن إزالتها، immunolabeled بواسطة الأجسام المضادة متعددة، والحجم تصوير.

Abstract

تحديد واستكشاف المنظمة مفصلة من الأجهزة أو الجسم كله على المستوى الخلوي تحديات أساسية في البيولوجيا. تتطلب أساليب الانتقالية قدرا كبيرا من الوقت والجهد للحصول على صورة 3D وبما في ذلك باجتزاء الأنسجة سليمة، immunolabeling، والتصوير الأنسجة مقطوع متسلسل، الذي ينتج فقدان المعلومات في كل خطوة من هذه العملية. في المناهج المطورة حديثا عالية الدقة التصوير داخل الأنسجة سليمة، وقيدت التوصيف الجزيئي لوضع العلامات على البروتينات. ومع ذلك، بروتوكولات المتاحة حاليا لتطهير الجهاز تتطلب الوقت عملية طويلة إلى حد كبير، مما يجعل من الصعب تنفيذ تقنيات إزالة الأنسجة في المختبر. أنشأنا مؤخرا يسمى بروتوكول السريع ودرجة عالية من استنساخه ACT-المعزوفة (أ التفاعلية الذي نظمه ج larity ر echnique- ص ص ressure مبتهج ه fficient والصورة الجدول ر ransferمن الجزيئات إلى س rgans)، والذي يسمح لإزالة الأنسجة في غضون عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، ACT-المعزوفة تمكن immunolabeling السريع مع الأساليب التقليدية ويسرع اختراق الأجسام المضادة في طبقة عميقة من تشكيل كثيفة، عينات سميكة من خلال تطبيق تدفق الضغط أو الحمل الحراري. نحن تصف كيفية إعداد الأنسجة، وكيفية مسح عن طريق إزالة الدهون باستخدام الكهربائي، وكيفية المناعية وصمة عار عن طريق تسليم بمساعدة الضغط. وسرعة وثبات بروتوكول الإسراع في أداء 3D البحوث النسيجي والتشخيص القائم على وحدة التخزين.

Introduction

واحدة من التحديات في علم الأعصاب هو التصور من دائرة الأسلاك العصبية والخلايا الفردية داخل أنسجة الدماغ سليمة. حتى وقت قريب، مما يدل على وصلات بين الخلايا العصبية في هذه الطريقة المطلوبة 1) باجتزاء المسلسل من الأنسجة. 2) وضع العلامات الجزيئية أهداف محددة، مثل محاور عصبية أو البروتينات. و3) التصور من إعادة الإعمار 3D من الدماغ كله عبر التخليص الحسابية أو محاذاة 2D الصور المتسلسلة ^1. هذه الخطوات هي شاقة، تتطلب قدرا كبيرا من الوقت، وعرضة لفقدان المعلومات أثناء باجتزاء ووضع العلامات، مما يجعل رسم الخرائط شبكة الخلايا العصبية صعبة للغاية. ومع ذلك، فقد تم تطوير العديد من الطرق التي تسمح لتصور من أنسجة سليمة دون باجتزاء. الأنسجة البيولوجية يمكن أن تكون شفافة بصريا من خلال تقنيات النسيج إزالة ^2-10. واحدة من الطرق الرئيسية هي للحد من الخلافات معامل الانكسار بين أنسجة سليمة والحل الغمر من أجلللحد من تشتت الضوء في أنسجة سليمة، مما يجعل الأنسجة شفافة وتمكين مراقبة البنى العميقة. بعض أنواع من الحلول الغمر لها خصائص مسعور، مما يؤدي إلى تبريد الفلورسنت سريع أثناء إجراء الجفاف. لذلك، هذه الأساليب غير متوافقة مع التصوير الفلورسنت على مدى فترة طويلة من الزمن ^11،12. بدلا من الكواشف مسعور، وأساليب أخرى تستخدم الكواشف ماء للمقاصة الأنسجة، مثل SeeDB ⁴ وهيئة السلع التموينية ل ه ^6، التي تحافظ على المعلومات الهيكلية ومضان من ^4،6،8 الأنسجة البيولوجية. ومع ذلك، الجزيئات، بما في ذلك الأجسام المضادة، لا يمكن أن تصل إلى جوهر أنسجة سليمة عن طريق الانتشار وحدها. ولذلك، فإن ما قبل وضع العلامات من الجزيئات المستهدفة في المناطق العميقة من الأنسجة المزدحمة بالسكان، يمثل تحديا تقنيا.

في البلدان المتقدمة مؤخرا طريقة الأنسجة المقاصة وضوح ^3، ط الأنسجة البيولوجية جزءا لا يتجزأ من هيدروجيلق شكلت مع مادة الأكريلاميد، وتتم إزالة الدهون من قبل الكهربائي تحت دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) حل المحتوية. ثم تغمر العينة في محلول مع مؤشر يعكس مطابقة للحد من تشتت الضوء ^3. تم تعديل نظام إزالة الدهون في وقت لاحق في وضوح متقدمة ¹³ و باكت (تقنية الوضوح المنفعلة) ^10. بعد البلمرة، وسلاسل الأكريلاميد تشعبي مع البروتينات، وتشكيل هيدروجيل الأنسجة. مكونات الدهون لا يمكن تشعبي مع مادة الأكريلاميد. وبالتالي، والدهون يمكن القضاء عليها من قبل الكهربائي تحت المخزن المؤقت SDS التي تحتوي على. من خلال القضاء الفعال من الدهون، وأنسجة المخ يزيد بشكل واضح في الشفافية ^9. ومع ذلك، هذه الأساليب لا تعالج استحالة العميق وضع العلامات عن طريق الانتشار مجانا. للتغلب على هذا القيد، يطلب من تقنيات لنقل نشط من الكواشف في الأجزاء الأعمق من الأنسجة السميكة.

على الرغم من وضوح يسمح المقاصة الأنسجة والأنسجة العميقةالتصور، فإنه ليس إجراء سهلة أو سريعة. يمكن أن يستغرق عدة أسابيع لمسح كامل ^7،14 مخ الفأر. المقاصة السريع للأنسجة أمر ضروري لتطبيق مثل هذه الأساليب لضبط المختبرية الأساسية أو السريرية لبحوث علوم الحياة أو تشخيص حجم. وينص البروتوكول الحالي عملية مبسطة لإزالة الأنسجة البيولوجية وكشف عن البروتين لاحق من قبل بمساعدة ضغط التسليم المناعية تلطيخ. انها مناسبة لعالية الدقة حجم التصوير من أنظمة معالجة البيانات الكبيرة المقدمة و 3D من خلال الجمع مع أساليب التصوير.

Protocol

يجب أن التجارب على الحيوانات تتوافق مع جميع الأنظمة الحكومية والمؤسسية ذات الصلة. 1. إعداد الكواشف من أجل حل هيدروجيل مونومر (A4P0): إضافة 20 غرام من مادة الأكريلاميد إلى 450 مل من 0.1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وضبط مستوى الصوت إلى 500 مل مع 0.1X برنامج تلفزيوني. تنبيه: أحادية الأكريلاميد السامة. تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك درع الوجه، معطف المختبر، والقفازات، والأحذية المغلقة اصبع القدم. مباشرة قبل الاستخدام، وإضافة 100 ملغ من 2،2'-Azobis [2- (2-imidazolin-2-YL) البروبان] هيدروكلوريد إلى 40 مل من محلول هيدروجيل مونومر (A4P0) في أنبوب مخروطي 50 مل تحت غطاء الدخان . لعازلة المقاصة الأنسجة الكهربي (ETC): إضافة 40 غرام من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) و12.37 غرام من حمض البوريك إلى 800 مل من H 2 O منزوع الأيونات (درهم 2 O). ضبط درجة الحموضة إلى 8.5 مع هيدروكسيد الصوديوم وضبط مستوى الصوت ل1 لتر مع إضافي درهم 2 O. تنبيه: SDS هو مادة كيميائية ضارة. وبالتالي، التعامل معها بحذر. من أجل حل مكعب جبل: إضافة 250 غرام من السكروز، 125 غرام من اليوريا، و 125 غرام من N، N، N '، N' -tetrakis (2-هيدروكسي) الإيثيلين إلى 150 مل من O 2 درهم وتبرزي حجم إلى 500 مل مع DH 2 O. 2. تحضير العينة والتثبيت القتل الرحيم للفأرة. إعداد alfaxalone (1 ملغ / كلغ) وزيلازين (0.5 ملغ / كلغ) في نفس الحقنة. البريتونى حقن خليط من alfaxalone وزيلازين والسماح 3 دقائق عن الماوس ليصبح فاقدا للوعي. انتظر حتى الماوس مخدرة لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة الذيل، قبل المتابعة. تنبيه: اتبع الإرشادات المؤسسية المناسبة للتعامل مع الحيوانات. Transcardially يروي الماوس مع 100 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7،4-7،5) حلتحتوي الهيبارين (100 U / مل) ليستنزف، تليها 100 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) 14. تنبيه: PFA الحل هو السامة. يجب أن تتم إعداد الحل PFA وعن معالجة لاحقة في غطاء الدخان ومع معدات الوقاية الشخصية. قطع رأس الفأر، وفتح الجلد، وكسر في الجمجمة بين العينين باستخدام مقص صغير. إزالة قطعة من الجمجمة باستخدام الصغيرة، وملقط منحنية. إخراج المخ أو الأجهزة المطلوبة. احتضان خلايا المخ والأعضاء في ما بعد الإصلاح-4٪ حل PFA في 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: للحصول على المقاصة الأنسجة الخاصة بكل منطقة، تشريح منطقة معينة أو تقليم النسيج بعد تثبيت الأنسجة. تنبيه: PFA الحل هو السامة. يجب أن تتم نضح transcardial وعن التعامل مع الماوس لاحق في غطاء الدخان ومع معدات الوقاية الشخصية. 3. هيدروجيل الأحادي تسريب وبولymerization احتضان الأجهزة الثابتة في A4P0 حل هيدروجيل مونومر في 4 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة مع الهز لطيف. هيدروجيل مونومر-غرست البلمرة الأنسجة. نقل العينة إلى 10 مل أنبوب مستديرة أسفل مع 5 مل من محلول هيدروجيل مونومر. لف الجزء العلوي من أنبوب مستديرة أسفل مع بارافيلم. إزالة الأكسجين من أنبوب جولة القاع التي تحتوي على الماوس كله عينة الدماغ التي غرست هيدروجيل التي ظهرت على السطح النيتروجين من خلال السائل لمدة 1 دقيقة. بسرعة وبإحكام إغلاق أنبوب يحتوي على عينة. نقل أنبوب إلى حمام مائي (37 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة. غسل العينة بلمرة لفترة وجيزة مع 0.1X برنامج تلفزيوني لإزالة هيدروجيل الزائد. تنبيه: أحادية هيدروجيل سامة. لتجنب ملامسة الجلد مع مونومر هيدروجيل، تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء الدخان ومع معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك درع الوجه، معطف المختبر، والقفازات. ملاحظة: بلمرة الأنسجةيمكنك خزنها في 0.1X برنامج تلفزيوني تحتوي على أزيد الصوديوم لأكثر من 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. تنبيه: أزيد الصوديوم هو غاية وشديدة السمية. تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء الدخان ومع معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك درع الوجه، معطف المختبر، والقفازات. 4. الكهربي الأنسجة المقاصة (ETC) نقل العينة بلمرة إلى حاوية الأنسجة ووضع الحاويات الأنسجة في غرفة ETC. تملأ الغرفة ETC مع العازلة ETC باستخدام مضخة peristatic. تهيئة الظروف ETC وتشغيل والتدريب. استخدام الإعدادات التالية. لإعدادات ETC لأجهزة كاملة، واستخدام الإعدادات التالية: (1.5 أمبير)، ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية)، وإدارة الوقت (6.0 ساعة)، سرعة مضخة (30 دورة في الدقيقة). لإعدادات ETC لشرائح دماغ الفأر سميكة 1- إلى 2 ملم، واستخدام الإعدادات التالية: التيار (1.5 أمبير)، ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية)، وإدارة الوقت (2.0 ساعة)، سرعة مضخة (30 دورة في الدقيقة). نقل رانه مسح العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع 45 مل من 0.1X برنامج تلفزيوني. غسل مسح عينة عدة مرات مع 0.1X برنامج تلفزيوني حتى يروا أي فقاعات عندما تهتز أنبوب لفترة وجيزة (لتأكيد الإزالة الكاملة للSDS). 5. Immunolabeling من الأنسجة المصنعة ACT للدماغ الفأر كله: احتضان عينة في حجم 3 مل من محلول الأجسام المضادة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X، 6٪ زلال المصل البقري (BSA)، 0.1٪ تريتون X-100، و 0.01٪ أزيد الصوديوم (الأجسام المضادة حل تمييع) مع تخفيف عامل 1/500 لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) الأجسام المضادة لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. استبدال حل الأجسام المضادة في نهاية يوم 2. غسل العينة في أنبوب مخروطي 50 مل مع 45 مل من 0.1X برنامج تلفزيوني لمدة 3-5 ساعة وتغيير المخزن المؤقت كل ساعة. احتضان عينة في حجم 3 مل من محلول الأجسام المضادة تخفيف مع عامل تخفيف 1/500 للحمار المضادة للأرنب 488 الضد الثانوية لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. REPLالآس الحلول الضد المخفف في يوم 2. ل1- إلى 2 مم الأنسجة شرائح الدماغ: احتضان العينة بين عشية وضحاها أو لمدة تصل إلى 1 اليوم في 0.5- إلى 1 مل حجم محلول الأجسام المضادة تخفيف مع عامل تخفيف 1/500 للنوع الكولاجين الرابع الأضداد في 37 ° C مع اهتزاز خفيف. غسل العينة في أنبوب مخروطي 15 مل مع حجم 12 مل من 0.1X برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 ساعة. تغيير المخزن المؤقت كل ساعة. احتضان العينة في 0.5- إلى 1 مل حجم محلول الأجسام المضادة تخفيف مع عامل تخفيف 1/500 للو Cy3، مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية بين عشية وضحاها أو لمدة تصل إلى 1 اليوم عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. غسل العينة في 0.1X برنامج تلفزيوني لمدة 3-5 ساعات. تغيير المخزن المؤقت كل ساعة. قبل التصوير، واحتضان العينة في كمية مناسبة من محلول جبل CUBIC لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف. استبدال حل مكعب جبل الطازجة واحتضان ل1 ساعة إضافية. ملاحظة: </b> 76 نوع من الأجسام المضادة نجحت في الماوس الأنسجة المصنعة ACT، بما في ذلك 31 الاجسام المضادة 14. قبل المسمى الأنسجة يمكن جنبا إلى جنب مع immunolabeling من اثنين من أكثر fluorochromes في الأنسجة المصنعة ACT. 6. Immunolabeling من الأنسجة الكثيفة (المعزوفة) ج-المعزوفة ملاحظة: ج-المعزوفة مناسبة لعينات صغيرة الحجم، مثل الخصية كلها، الكلى كله، أو أجزاء صغيرة من أجهزة أكبر. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل، إضافة 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة حل تمييع مع عامل تخفيف 1/500 لنوع الكولاجين الرابع الأضداد، وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 600 × ز لمدة 2 ساعة. غسل عينة ملطخة 0.1X برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 30 دقيقة. إضافة 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة حل تمييع مع عامل تخفيف 1/500 عن الأجسام المضادة و Cy3 مترافق المضادة للأرنب الثانوية وأجهزة الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 2 ساعة. غسل عينة ملطخة 0.برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 30 دقيقة. ليالي المعزوفة ملاحظة: S-المعزوفة هي مناسبة لأنسجة أكبر. تحضير حقنة (حجم 30 مل) وتوصيله إلى 3 في اتجاه وصمام (الشكل 1A). الغراء صمام بمسدس الغراء لظروف الضغط العالي (الشكل 1B). نقل العينة إلى 3-طريقة الحقنة متصل صمام في موقف مغلقة صمام. إضافة 5-7 مل من الأجسام المضادة حل تمييع مع عامل تخفيف 1/500 لنوع الكولاجين الرابع الأضداد. الافراج عن حل الأجسام المضادة في عينة عن طريق فتح صمام. تعيين مكبس المحقنة إلى موقف 17 مل لتوفير مساحة كافية للحركة التسريب / انسحاب. ويمكن القيام بذلك في موقف فتح صمام. إغلاق 3 في اتجاه وصمام بعد الانتهاء من وضع حقنة. وضع حقنة تحتوي العينة على ضخ حقنة. تهيئة الظروف ضخ حقنة لحجم التسريب / انسحاب من 10 مل / دقيقة و4-دقيقة وقفة الوقت على وضع دورة مستمرة (الشكل 1C). ملاحظة: المضخة ينفخ حتى تصل إلى حجم الهدف (10 مل)، ثم الاتجاه للتغيرات التدفق بعد توقف قصير (4 دقائق). تشغيل ضخ حقنة ل3-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1F). فتح 3 في اتجاه وصمام واستبدال الحل مع 0.1X برنامج تلفزيوني. غسل العينة الملون مرتين مع 0.1X برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في كل مرة باستخدام مضخة الحقنة. تغيير مع حل الأجسام المضادة تخفيف تحتوي و Cy3 مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية (عامل التخفيف من 1/500) وتشغيل ضخ حقنة ل3-24 ساعة. فتح 3 في اتجاه وصمام واستبدال الحل مع 0.1X برنامج تلفزيوني. قبل التصوير، واحتضان العينة الملون في كمية مناسبة من محلول جبل CUBIC لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف. استبدال حل مكعب جبل الطازجة واحتضان ل1 ساعة إضافية. 7. أناmaging وضع الأنسجة وصفت في طبق متحد البؤر وإضافة مكعب جبل حل حتى يتم تغطية الأنسجة. وضع ساترة على الأنسجة. استخدام المجهر متحد البؤر لصورة النسيج 14 في إطار الهدف 10X.

Representative Results

المقاصة ACT الأنسجة أحد العوامل الهامة التي تؤثر المقاصة الأنسجة هو تثبيت الأنسجة. PFA تثبيت وضخ مادة الأكريلاميد خطوات منفصلة في هذا البروتوكول. بعد الخطوة البلمرة الأنسجة هيدروجيل، لا يتم بلمرة حل A4P0 مجانا، على الرغم من الهلاميات المائية التي غرست الأنسجة هي عبر ربط مع الجزيئات الذاتية. لذلك، يجب أن لا جيل تشكل خارج من الأنسجة (الشكل 2A). نتائج الإجراء ACT في أقل عبر ربط بين البروتينات ومادة الأكريلاميد مقارنة بروتوكول وضوح. وفقا لذلك، وعينة الأنسجة هيدروجيل أكثر مسامية. وتمكن هذه الميزة استخراج سريع من الدهون وانتشار الجزيئات. وكانت 6 ساعات من ETC كافية لج – أقسام مخ الفأر 1- إلى 2 مم تم تطهير بما فيه الكفاية ضمن 1-2 ساعة (الشكل 2B)، و 5learance من أدمغة فئران كاملة (الشكل 2C). يسببها المقاصة النسيج بوساطة هيدروجيل توسيع الأنسجة بعد خطوة الخ، ولكن عادت الأنسجة إلى حجمها الأصلي في انعكاس حل يقابل مؤشر. عينة الأنسجة هيدروجيل شكلت في إجراء ACT هي التي يسهل اختراقها للغاية، وبالتالي، يمكن أن المركبات الصغيرة والجزيئات تخترق بكفاءة وتنتشر بسهولة (الشكل 3). بعد حضانة 2 ساعة من شرائح الدماغ 1 ملم مع هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ونوع الكولاجين الرابع الأضداد، كانت اللاحقة 2-ح الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية كافية لتسمية الخلايا العصبية الدوبامين على عمق 500 ميكرومتر (الشكل 3) . Immunolabeling المعزوفة الأنسجة لديها أجهزة كثيفة عموما تركيزات عالية من الألياف ECM، مما يؤثر على اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. وهكذا، والأجسام المضادة penetمصنفة على عمق فقط 20-30 ميكرومتر في الأنسجة الكثيفة، مثل نسيج الكلى، بعد 12 ساعة من الحضانة. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتصميم طرق اختراق جزيء النشطة التي تمكن من تقديم الكواشف إلى الأنسجة العميقة، وهي المعزوفة (ضغط المتعلقة نقل فعال ومستقر من الجزيئات في الأجهزة) (الشكل 4). مقارنة حضانة ثابتة من نسيج الكلى المصنعة ACT مع حلول الأجسام المضادة، وتطبيق قوى الطرد المركزي (600 x ج) مع طاولة قمة الطرد المركزي (المعزوفة الطرد المركزي، ج-المعزوفة) تحسنت كثيرا تسليم الأجسام المضادة إلى الأنسجة العميقة (الشكل 5). عندما طبقنا إجراءات ج-المعزوفة إلى الأنسجة الكثيفة، وكانت 3 ساعة من الحضانة كافية لتسمية 250- إلى البنى العميقة 300 ميكرون. لتحسين تشويه الأنسجة دون تلف الأنسجة كبير، ونحن أيضا تصميم الجهاز الذي يوفر تدفق الحراري مع ضخ حقنة (المعزوفة حقنة، S-المعزوفة). هذه العملية تحسن مماثل المؤسسة العامة الأجسام المضادة netration مقارنة الانتشار السلبي (الشكل 5). الشكل 1. إعداد الجهاز ليالي المعزوفة. A. حقنة (30 مل) وثلاثي محبس. ب- ثلاثي محبس اتصال ولصقها على حقنة. جيم حقنة تحتوي على محلول العينة والأجسام المضادة، والحقنة وضعت على ضخ حقنة. دال ضخ حقنة والإعداد حالة صالحة للعمل. هاء مضخة ينفخ محلول يحتوي على الكواشف وضع العلامات في العينة. عندما تصل إلى حجم معين، يتغير اتجاه الضخ وتنسحب الحل بعد فترة محددة من الزمن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <p class="jove_content" fo:keep-together.within الصفحات = "1"> الشكل 2. ACT المقاصة أنسجة مخ الفأر. A. بعد البلمرة، لا يتم بلمرة حلول A4P0 الحرة؛ وgelated الهلاميات المائية التي غرست الأنسجة التي عبر ربط مع الجزيئات الذاتية. B. 1- إلى شرائح سميكة الدماغ 2 ملم تم تطهير 1 – 2 ساعة، ومدى التوسع والانتعاش حجم في مؤشر يعكس سجلت (RI) حل -matching. جيم سمك دماغ الفأر كله حوالي 0.8 سم، و5-6 ساعة من ETC كان كافيا لواضح تماما الدماغ. بعد 3 ساعات من ETC، كان هناك قدر كبير من الأنسجة غير تطهيرها. قبل 6 ساعات من غيرها، ولكن والمقاصة من الدماغ بأكمله قد وقعت. لون الأنسجة بعد ACT في المخزن المؤقت ETC أبيض أو مبهمة. قبل تعديل RI، الأنسجة تصبح شفافة. الرجاء الضغط عليهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. Immunolabeling مع أنسجة مخ الفأر تطهيرها ACT. الصور من 1 ملم شرائح دماغ الفأر المصنعة ACT تظهر قشرة مخ الفأر ملطخة أجسام مضادة لنوع الكولاجين الرابع وجزء من الدماغ المتوسط ​​ملطخة أجسام مضادة لهيدروكسيلاز التيروزين (TH). شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم طرق immunolabeling 4. المعزوفة. الأجسام المضادة لا يمكن أن تخترق الأنسجة الكثيفة عن طريق الانتشار. تم تصميم طرق المعزوفة immunolabeling للبث بنشاط الجزيئات وتقديم الكواشف إلىالأنسجة الكثيفة. تطبيق قوى الطرد المركزي باستخدام فوق المنضدة الطرد المركزي القياسي (المعزوفة الطرد المركزي، ج-المعزوفة) سهلت بشكل ملحوظ تسليم الأجسام المضادة. Appling التدفق الحراري مع ضخ حقنة (المعزوفة حقنة، ق-المعزوفة) تحسين اختراق الأجسام المضادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5. المعزوفة immunolabeling من الأنسجة الكثيفة تطهيرها ACT. لج-المعزوفة، تم طرد الأنسجة في 600 x ج لمدة 3 ساعات باستخدام معيار فوق المنضدة الطرد المركزي من أجل الإسراع في اختراق الأجسام المضادة الأولية والثانوية. ليالي المعزوفة، تم استخدام مضخة الحقن لتقديم الأجسام المضادة. أجهزة الماوس، مثل الكلى والكبد، وصفت مع نوع الكولاجين الرابع. بالمقارنة مع الطرق التقليدية، 3 ساعات منج- أو S-المعزوفة بشكل ملحوظ يعزز وضع العلامات العمق. في الكلى والكبد، وعمق من المحور Z يصل 300-350 ميكرون أو أعمق في عينات المعزوفة (اليمين)، في حين وصفت عينات السيطرة على عمق فقط 40 – 50 ميكرون (يسار). تم الحصول على صورة أعيد بناؤها 3D مع المجهر متحد البؤر. شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الفقراء تثبيت أو الغمر هيدروجيل إلى الأنسجة يمكن أن يسبب فقدان البروتينات وتشويه الأنسجة أثناء عملية تطهير الأنسجة. يجب حضنت الكبار كله مخ الفأر في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها، تليها الانغماس في حد أدنى لحجم 20 مل من هيدروجيل حل مونومر ل12-18 ساعة مع الهز لطيف. لأنسجة كبيرة، بما في ذلك الأنسجة البشرية مثل شرائح الدماغ والحبل الشوكي، وسعت تمرغ الوقت في حل هيدروجيل مونومر هو مطلوب. بروتوكول ACT ينطبق بسهولة إلى إزالة الأنسجة الثابتة ليتم فصل خطوات تثبيت الأنسجة وحقن البوليمر. بعد تطهير الأنسجة، والأنسجة البشرية الملون بشكل جيد مع العديد من الأجسام المضادة. لاحظ أن هذه التقنية ACT المقاصة ليست متوافقة مع مثبتات الكحول، مثل الإيثانول والميثانول.

الخطوة البلمرة الأنسجة هيدروجيل أمر بالغ الأهمية لإنتاج أنسجة نوعية جيدة بعد عملية المقاصة أيضا. لانالأكسجين يمنع البلمرة الأكريلاميد، يجب إزالته بواسطة التفريغ الحل التي تحتوي على الأنسجة تحت نظام النيتروجين ضخ الغاز. بدلا من ذلك، إزالة الأوكسجين التي يمكن تشغيلها باستخدام فراغ الغرفة مع كتلة الحرارة لمدة 23 ساعة.

معدل المقاصة يعتمد على عوامل عديدة، بما في ذلك حجم الجهاز، ومحتويات الدهون أو ECM البروتينات الليفية، وحالة من التثبيت، وما إلى ذلك معظم الأنسجة الماوس الكبار يمكن إزالتها عن طريق ETC بين عشية وضحاها. ومع ذلك، هناك خطر لا لزوم لها على مدى المقاصة وتورم الأنسجة. وبالتالي، فإن الاختلافات في وقت المقاصة هي من الاعتبارات المهمة. يجب أن تحدد شروط الأنسجة إزالة تجريبيا. الأهم من ذلك، محتويات ECM قد تؤثر على ظهور أنسجة مسح. لون الأنسجة يبقى أبيض أو مبهمة، وحتى بعد ACT في المخزن ETC، لأن القانون لا مسح ألياف البروتين الكثيفة. ومع ذلك، عندما كانت مغمورة هذه الأجهزة في ري حل مطابقة، وأصبح ذ شفافة.

ويبدو أن معدل تورم الأنسجة أن تعتمد على محتويات ECM من الأنسجة، والأجهزة لينة، مثل الدماغ، يحمل نسبة التورم أكبر من أجهزة الكثيفة. لأن زيادة الأنسجة تورم سيساعد هذا الإجراء الأنسجة المقاصة، ACT بشكل روتيني يستخدم المقطر عازلة المياه القائمة في معظم الحالات. في بعض الحالات، عندما تورم الأنسجة أو تشوه عابرة غير مرغوب فيه، كما هو الحال في الأجنة، ويمكن تطبيقها العازلة التي تحتوي على 0.1X برنامج تلفزيوني عالية الدقة التصوير. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن تركيز الملح أعلى في المخزن المؤقت قد يتسبب في انكماش الأنسجة.

طريقة ACT يمكن توضيح الأجهزة كلها، وحتى الجسم كله على فأرة الحاسوب ^14. ومع ذلك، والتصوير الأنسجة العميق من نسيج شفاف يتطلب المجاهر وأهداف خاصة. وهكذا، أنسجة المخ 1- إلى 2 مم هو الأكثر فعالية للتصوير مع المجهر متحد البؤر التقليدية. في أيدينا، وإزالة الملصقالأجسام المضادة إد من الأنسجة المصنعة ACT هي التي تعتمد على الأجسام المضادة، ولا ينصح جولات من مختلف العلامات الأجسام المضادة. عدة الأجسام المضادة، مثل TH وGFAP، عملت بشكل جيد وخاصة لكامل الدماغ immunolabeling ^14. من ناحية أخرى، فإن بعض الأجسام المضادة، مثل Tuj1 أو MAP2، وغالبا ما وصفت فقط من سطح الأنسجة. يمكن تحسين ذلك عن طريق وسائل أخرى، مثل سويتش ^15. الحد محتمل آخر هو أنه قد يكون من الصعب الحفاظ على الهياكل بروتين الجميلة في الأنسجة المصنعة ACT بسبب تورم الأنسجة وانكماش خلال خطوة إزالة الأنسجة.

تقنية المعزوفة هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من تقنيات النسيج وضع العلامات. على سبيل المثال، في وسائل الأنسجة شفافة باستخدام الأنسجة وصفت مسبقا، مثل SeeDB ⁴ و ⁷ iDISCO، immunolabeling من الأنسجة الكثيفة يتطلب فترات حضانة أطول من عدة أيام إلى أسابيع. ومع ذلك، يمكن المعزوفة تقصير فترة حضانة لعدة ساعات، والبريدnabling الانتهاء من العملية برمتها في غضون يوم مع 1 ملم الأنسجة الكثيفة سميكة. المعزوفة يمكن أن تعزز فعالية العميق وضع العلامات سميكة، والأنسجة الكثيفة، أو الأنسجة السميكة حتى الامم المتحدة تطهيرها. لأن المعزوفة يستخدم جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة أو ضخ حقنة و لا يتطلب أي معدات خاصة، فمن السهل نسبيا لتنفيذ هذه التقنية مع الإجراءات المخبرية الروتينية.

Materials

4% Paraformaldehyde	Lugen SCI	LGB-1175-4B	sample fixation
Acrylamide	Affymetrix	75820	Hydrogel monomer solution
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride	Wako Pure Chemical Industries	VA-044	Hydrogel monomer solution
Boric acid	Affymetrix	76324	ETC buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix	18220	ETC buffer
Sodium hydroxide pellets	Junsei chemical	1310-73-2	ETC buffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323A	Immunolabeling
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Immunolabeling
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Immunolabeling
Collagen type Ⅳ	Abcam	AB6586	Antibody/immunolabeling
Tyrosine hydroxylase (TH)	Millipore	AB152	Antibody/immunolabeling
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Secondary antibody/ immunolabeling
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Life Technologies – Molecular Probes	A21206	Secondary antibody/ immunolabeling
Confocal dish	SPL lifesciences	101350	Imaging
Confocal microscope	Leica	SP8	Imaging
Sucrose	Junsei chemical	31365-0301	CUBIC-mount solution
Urea	Affymetrix	23036	CUBIC-mount solution
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma-Aldrich	122262	CUBIC-mount solution
ECT chamber	Logos Biosystems, Inc.	C10101	ETC system
ECT chamber controller	Logos Biosystems, Inc.	C10201	ETC system
Temperature probe	Logos Biosystems, Inc.	C12101	ETC system
Peristatic pump	Baoding longer precision pump Co., Ltd	YZ1515X	ETC system
Buffer reservoir	Logos Biosystems, Inc.	C10401	ETC system
Tissue container	Logos Biosystems, Inc.	C12001	ETC system
Container holder for 1 tissue container	Logos Biosystems, Inc.	C12002	ETC system
Mouse brain slice holder	Logos Biosystems, Inc.	C12004	ETC system
Whole rat brain holder	Logos Biosystems, Inc.	C12007	ETC system
Peristaltic pump tubing	Logos Biosystems, Inc.	C12104	ETC system
Tabletop-centrifuge	Hanil science industrial Co., Ltd	MICRO 12	c-PRESTO
Syringe pump	Baoding longer precision pump Co., Ltd	LSP02-1B	s-PRESTO
Syringe (20 ml)	Korea vaccine Co., Ltd.	KV-S20	s-PRESTO
3-way stopcock	Hyupsung medical Co.,Ltd.	HS-T-01N	s-PRESTO