Insuline-geïnduceerde vasodilatatie regelt spier perfusie en verhoogt de Microvasculaire oppervlakte (microvasculaire werving) beschikbaar voor opgeloste uitwisseling tussen bloed en weefsel interstitium. Gecombineerde intravital microscopie en contrast-enhanced Ultrasonografie is bedoeld om te beoordelen gelijktijdig insuline de actie op de grotere schepen en de microcirculatie in vivo.
Het is aangetoond dat insuline de vasculaire acties tot de regulering van de insulinegevoeligheid bijdragen. Insuline de effecten op de spier perfusie regelen postprandiale levering van voedingsstoffen en hormonen aan insuline-gevoelige weefsels. Hier beschrijven we een techniek voor het combineren van intravital microscopie (GODT) en contrast-enhanced Ultrasonografie (CEUS) van de adductor compartiment van de muis stuk spier weerstand slagaders gelijktijdig te visualiseren en perfusie van de microcirculatie in vivo. Insuline de effect op meerdere niveaus van de vasculaire boom tegelijkertijd te bepalen is het belangrijk te onderzoeken relaties tussen insuline van meerdere vasoactieve effecten en spier perfusie. Experimenten in deze studie werden uitgevoerd in muizen. Ten eerste, de staart ader canule wordt ingevoegd voor de infusie van anesthesie, vasoactieve verbindingen en echografie contrast agent (lipide-ingekapseld microbellen). Ten tweede, een kleine incisie wordt gemaakt in de liesstreek bloot de arteriële boom van het compartiment van de musculus adductor. De ultrasone sonde geplaatst dan aan de contralaterale bovenste stuk te bekijken van de spieren in doorsnede. Om te beoordelen volgens basislijn parameters, de arteriële diameter wordt beoordeeld en microbellen vervolgens met een constante snelheid te schatten van de doorbloeding van de spier en microvasculaire bloed volume (MBV) worden toegediend. Wanneer toegepast vóór en tijdens een hyperinsulinemic-euglycemic-klem, toestaan gecombineerde GODT en CEUS beoordeling van insuline-geïnduceerde veranderingen van arteriële diameter, spier microvasculaire perfusie en hele lichaam insulinegevoeligheid. Bovendien kan de temporele relatie tussen reacties van de microcirculatie en de slagaders resistentie aan insuline worden gekwantificeerd. Het is ook mogelijk om follow-up van de muizen overlangs in tijd, waardoor het een waardevol hulpmiddel om te studeren van wijzigingen in vasculaire en hele lichaam insulinegevoeligheid.
In antwoord op een stijging van de bloedglucose niveau scheidt de alvleesklier insuline in de bloedbaan, waar het wordt snel verspreid onder haar onderzoeken weefsels, zoals skeletspieren, via weerstand aders en haarvaten. Skeletspieren is verantwoordelijk voor ~ 80% van de postprandiale glucose opname1. De levering van insuline aan de skeletspieren interstitium gebleken te zijn van een snelheidsbeperking stap voor de metabole acties van insuline die glucose verwijdering2,3,4te bevorderen. Binnen 10-15 min verhoogt insuline het capillaire bloed volume (microvasculaire werving), een effect dat optreedt voordat de totale doorbloeding stijgt5,6. Microvasculaire werving breidt de endothelial oppervlakte beschikbaar voor uitwisseling van voedingsstoffen (en insuline)7,8. Insuline-gemedieerde microvasculaire aanwerving voorafgaat aan en is onafhankelijk geassocieerd met veranderingen in skeletspieren glucose opname8,9. Het effect van de insuline op de therapieën is ‘vasculaire insulinegevoeligheid’ genoemd.
Het is aangetoond dat insuline-gemedieerde microvasculaire werving en insuline-geïnduceerde vasodilatatie beperkingen in zwaarlijvige Zucker-ratten-10,11 ondervinden. Bovendien, mager muizen met verminderde capillaire dichtheid spier insuline resistentie12weergeven In hun invloedrijke werk toonde Kubota et al. dat verminderde insuline signalering in de endotheliale cellen veroorzaakt vermindering in insuline-geïnduceerde microvasculaire werving, die glucose opname in skeletspier met ongeveer 40%13verminderd. Deze abnormaliteiten in microvasculaire functie treden niet alleen op in de spier, maar ook in meerdere andere weefsels en organen zoals het hart, netvlies en nier14,15,16. Deze voorbeelden en andere studies17,18,19,20 suggereren dat vasculaire effecten van insuline een belangrijk mechanisme in de (patho) fysiologie van insulineresistentie zijn en haar complicaties.
Hoewel er afdoende bewijzen dat insuline microvasculaire bloed volume (MBV) in skeletspieren5,6 verhoogt, zijn de mechanismen waarmee dit gebeurt niet volledig begrepen9. Endotheel-afhankelijke vasodilatatie is essentieel in veel aspecten van vasculaire insuline gevoeligheid21,22,23 op verschillende niveaus van de therapieën. Vasculaire insulinegevoeligheid kan manifesteren door insuline-geïnduceerde ontspanning van weerstand slagaders en ontspanning van vooraf capillaire arteriolen toe de microvasculaire uitwisseling geperfundeerd oppervlakte7,24, 25.
Intravital microscopie (GODT) is gebruikt in een verscheidenheid van weefsel preparaten, met inbegrip van huidplooien kamers van de muis dorsum26, mesenterium van de muis en rat27, modellen van ledematen ischemie in de muis28 en de hamster Wang etui 29. contrast-enhanced Ultrasonografie (CEUS) is een andere beeldvormende techniek waarmee de beoordelingvan de microcirculatie in cardiale30 evenals skeletspieren31. Het maakt gebruik van inert gas gevulde microbellen die rheologically als rode bloedcellen gedragen en blijven volledig binnen de vasculaire lumen. Deze microbellen worden intraveneus toegediend met een constante snelheid te bereiken van een steady-state. Een hoge energie echografie Golf, vervolgens kan worden gebruikt om te vernietigen de microbellen. De microbellen aanvulling snelheid in de regio van belang (ROI) vertegenwoordigt stroomsnelheid (MFV). De totale signaal intensiteit van de contrast-afbeelding vertegenwoordigt de MBV. CEUS kan herhaaldelijk worden uitgevoerd (ook bij de mens) en het heeft geavanceerde inzicht te krijgen in de vasculaire dysfunctie dat zich in insuline-resistente Staten voordoet (besproken in Barrett et al. 32).
In de huidige studie beschrijven we een nieuwe techniek voor het bestuderen van de regulering van de spier perfusie, door gelijktijdig gebruik van zowel GODT en CEUS. Hier richten we ons op de vasculaire acties van insuline in de adductor compartiment van het stuk van de muis. Dit compartiment is één van de grootste groepen van de skeletspieren in de muis, studies van lokale glucose opname in een representatieve spier inschakelen. Dit compartiment is ideaal voor GODT zoals de voorbereiding en de visualisatie van de bloedvaten gemakkelijk toegankelijk door een gestandaardiseerde chirurgische ingreep28 zijn. Bovendien, onze eigen fractie en anderen hebben aangetoond dat CEUS kan worden gebruikt in dit compartiment33,34.
Een voordeel van de gecombineerde GODT en CEUS techniek is de mogelijkheid van insuline uitwerking op het niveau van de grotere arteriolen (diervoeders of weerstand slagaders) en de microcirculatie (capillaire bedden) in de dezelfde spiergroep te kunnen beoordelen. Daarnaast is de gelijktijdige toepassing van de twee methoden biedt inzicht in de temporele werking van insuline op het niveau van de slagaders van de weerstand en de microcirculatie. Dit gecombineerd GODT en CEUS techniek kan ook worden geïmplementeerd in andere velden vasculaire biologie. Bijvoorbeeld, kan de rol van verschillende eiwitten en bepaalde pathofysiologische omstandigheden op het gebied van het endotheel bestudeerd worden met behulp van knock-out modellen. Bovendien kunnen beide technieken in één muisklik op meerdere tijdstippen vermindering van de tijd en de kosten van het onderzoek worden gebruikt.
We hebben een techniek om gelijktijdig schatten insuline de vasculaire acties op de grotere aders (met behulp van GODT) en de microcirculatie van de skeletspieren (met behulp van CEUS) ontwikkeld. De kritische stappen voor een succesvolle en betrouwbare metingen zijn: 1) correct bloot de slagader gracilis zonder verbloeden; 2) voorkomen lekkage van de paraffineolie baden de slagader; 3) hebben een octrooi veneuze toegang (staart ader canule) voor infusie van vasoactieve verbindingen (insuline) en contrast agent (microbellen).
De studie van microvasculaire dysfunctie in spier is het verkrijgen van aandacht in het kader van obesitas en insuline resistentie14,25,39,40. De negatieve gevolgen van obesitas en insulineresistentie op vasculaire functie manifesteert zich op verschillende niveaus van de vasculaire boom. Verschillende benaderingen moeten voortaan beoordeelt deze wijzigingen. Het gecombineerd gebruik van de GODT en CEUS technieken in de dezelfde muis biedt een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren van de effecten van insuline op verschillende niveaus van de therapieën. GODT biedt directe visualisatie en kwantitatieve analyse van de slagader van de weerstand en CEUS zorgt voor beoordeling van insuline-geïnduceerde veranderingen in spier perfusie.
Bestuderen van het compartiment van de musculus adductor heeft verschillende voordelen. De slagaders zijn gemakkelijk toegankelijk en het oppervlakkige karakter van de incisie maakt het mogelijk om de huid incisie met een 5.0 absorbeerbare steriel hechtdraad sluiten nadat het experiment is voltooid. De dieren waren subcutaan ingespoten met buprenorfine na de experimenten als pijnstiller bij een dosis van 0,1 mg/kg en toegestaan om te herstellen in een warme omgeving. De muizen getolereerd de procedure zeer goed en we ervaren geen verlies van dieren, noch infecties van het stuk in meer dan 35 dieren studeerde. Dit maakt het mogelijk om follow-up of de dieren in een longitudinale mode bestuderen. De dieren die worden gebruikt in deze experimenten, echter waren verdoofd met behulp van 1,8% ingeademd Isofluraan evenwichtig met zuurstof stroomt op 0.4 L/min al een verdoving masker. In tegenstelling tot Isofluraan verdoving41,42verstoort FMA verdoving perifere insulinegevoeligheid niet. Een toekomstplan is om te bestuderen hoe goed de muizen herstellen van FMA anesthesie.
Het compartiment van de musculus adductor is ook nuttig sinds verschillende vasoactieve verbindingen bemiddelen lokale en stroomafwaartse vasculaire effecten kunnen worden geëvalueerd. Topische toediening van deze verbindingen naar het doelweefsel is bijvoorbeeld haalbaar met behulp van superfusion technieken28 of chirurgische manipulatie en implantatie van drug-eluerende manchetten rond de schepen43. Bovendien kan de slagader gracilis worden geïsoleerd en studeerde in de druk-myograph. Onze fractie en anderen hebben verzameld aanzienlijke experimenteel bewijs met behulp van de druk-myograph voor het documenteren van de effecten van insuline en andere vasoactieve verbindingen op deze slagader ex vivo36,37,38.
Een beperking die inherent zijn aan het gebruik van de GODT-techniek is de chirurgische expositie van de spier en toepassing van paraffineolie te stabiliseren van de schepen. Het is niet duidelijk of de oorsprong van de slagader van de invloed van deze acties. Figuur 3A blijkt echter dat de diameter van de basislijn van de slagader van de gracilis badend in paraffineolie niet aanzienlijk gewijzigd. Het heeft ook aangetoond dat minerale olie met succes de diffusie van zuurstof, het weefsel te beschermen tegen hyperoxique voorwaarden44remt. Bovendien helpt de olie te reduceren van de variatie in de diameter van de basislijn van de slagaders. Dit is de reden waarom wij voorstander van paraffineolie gebruiken en laat de rest van de voorbereiding voor minstens 30 min. Van de nota resulteerde het gebruik van gebufferde zoutoplossing in plaats van olie- of geen olie helemaal – in zeer variabel diameters en vernauwing van het schip (gegevens niet worden weergegeven). Bovendien, we aan het eind van de experimenten, geïsoleerd van de slagaders gracilis – badend in paraffineolie – en getest hun reactiviteit in de druk-myograph ex vivo. De paraffine olie-gebaad slagaders gereageerd op dezelfde manier als u wilt bepalen van de slagaders wanneer gestimuleerd met insuline en acetylcholine (een vaatverwijdende) (gegevens niet worden weergegeven). De consistente insuline-geïnduceerde vasodilatatie toont duidelijk aan dat het protocol van de GODT beschreven in deze studie betrouwbare resultaten oplevert.
Het voordeel van de toepassing van beide technieken in de dezelfde muis overwint aantal intrinsieke beperkingen van een techniek die door de andere: CEUS schat MBV in het ongestoord spier in vivo, maar individuele vaartuigen niet zichtbaar; GODT maakt het mogelijk om te zien van individuele vaartuigen, zij het niet kan MBV schatten. Een toekomstplan is om te gebruiken GODT microscopie van de Musculus cremaster in combinatie met CEUS van de adductor spier aan de contralaterale zijde. Deze wijziging kan een schatting van de MBV (met behulp van CEUS) en directe optische toegang tot de haarvaten (met behulp van GODT) opleveren. Het protocol kan verder worden gewijzigd; de 4-weg-connector gebruikt voor de staart canule kan op een 5-polige connector worden geschakeld. Door dit, kunnen we voorkomen dat het loskoppelen van de verdoving buis tijdens het uitvoeren van de tweede CEUS meting (beschreven in punt 2.9). In onze ervaring, de muizen het huidige protocol goed getolereerd. Een andere wijziging die kan worden gemaakt bij dit protocol is de insuline klem snelheid gebruikt. Gebruikten we 7,5 mU/kg/min klem tarief, die wordt beschouwd als supra-fysiologische. Afhankelijk van de studie, kan een lager tarief van de insuline klem (bijvoorbeeld 3 mU/kg/min) worden gebruikt.
Terwijl we het beschreven protocol betrouwbaar hebben gevonden, zijn er bepaalde beperkingen die aandacht nodig hebben. Er zijn situaties waarin de meting van de arteriële diameter niet optimaal is. Het uitvoeren van de stappen van de voorbereiding vereist enige ervaring met het model. Het is cruciaal dat de paraffineolie niet lek uit de omgeving van het schip als haar aan te vullen met nieuwe olie zal verstoren van het vaartuig en het veranderen van de diameter, waardoor het noodzakelijk wordt om te laten de rest van de slagader voor een andere 30 min. Daarnaast is de reflectie van het licht (beschreven in stap 1.14 van het protocol) op het oppervlak van de paraffineolie was soms ook helder, waardoor het moeilijk is om weer te geven van de slagader. Dit kan worden tegengewerkt door het regisseren van de lichtbron zodat het licht op een hoek aan de paraffineolie oppervlak en evenwijdig aan de slagader valt.
Kortom, maakt de combinatie van GODT en CEUS technieken beschreven in deze studie het mogelijk te kwantificeren van de verschillende effecten van insuline op verschillende niveaus van de therapieën. GODT van de slagader gracilis biedt inzicht in de upstream vasculaire wijzigingen bijdragen naar downstream microvasculaire perfusie gemeten met behulp van CEUS. Wij pleiten voor de combinatie van verschillende experimentele technieken in de dezelfde muis beter beoordelen de vasculaire functie.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Ing. Duncan van Groen voor het programmeren van de afbeelding analysesoftware (ImageGrabber) gebruikt in deze studie. Financiering voor dit onderzoek is verstrekt door een VIDI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (grant 016.136.372).
C57BL/6 Mice | Charles river | Mice used were bred in-house | |
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system | VisualSonics inc. | ||
MS250 non-linear transducer | VisualSonics inc. | ||
Vevo 2100 software | VisualSonics inc. | ||
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves |
Vortex | VWR international | 58815-234 | |
Heating pad | Pantlab | ||
Freestyle Precision Xceed | Abbott | To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp | |
Insulin Novorapid | Novo Nordisk | ||
Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1083421000 | |
Buffered saline solution | B. Braun | 152118062 | |
PE-20 medical tubing | Becton, Dickinson and Company | 427405 | |
Needle, 27 Gauge | Becton-Dickinson & Co | 305109 | |
Medical tape | 3M | ||
Ultrasound probe holder | Built In-house | ||
Cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
Creme depilator | Multiple Equivalent | ||
Gel tissue adhesive | Derma+flex | GA30005-2222 | |
Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
Small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Straight forceps with fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
Camera | Basler | scA1390-17gc | |
Image Grabber program | Built in-house | Image acquisition system | |
Timer | VWR | 33501-418 | |
Syringes, 1 ml | Fisher | 14-817-25 | |
Light source, fiber-optic | Schott | KL1500 | Ideally has adjustable arms |
Paraffin oil | Multiple Equivalent | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbubbles | |||
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
polyoxyethylene stearate | Sigma | p3440 | |
perfluorobutane gas | F2 Chemicals | C4F10(g) | |
Decon FS200 ultrasonic bath | Decon Ultrasonics Ltd | ||
Vialmix | Lantheus Medical Imaging | 515370-0810 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc |