インスリン依存性血管拡張筋の血流を調節するなり、微小血管表面積 (微小血管募集) 溶質の交換に使用できる血液と組織の間質の間。生体顕微鏡を組み合わせたと造影超音波検査は同時に大きな船と微小循環でインスリンの作用を評価するために提示体内。
インスリンの血管アクションがインスリン感受性の調節に貢献することが実証されています。筋肉の血流のインシュリンの効果は、栄養素やホルモンのインシュリン敏感なティッシュへの配信食後を調節します。ここで生体顕微鏡 (IVM) と筋肉抵抗血管を同時に可視化するマウスの後肢筋内転筋コンパートメントおよび血流の造影超音波 (CEUS) を組み合わせるためのテクニックについて述べる、微小循環体内。同時に血管のツリーの複数のレベルでのインスリンの効果の評価は、インスリンの複数の血管作動性効果と筋血流との関係を研究することが重要です。本研究では実験はマウスで行われました。まず、麻酔、血管作動性化合物、超音波造影剤 (脂質でカプセル化されたマイクロバブル) の注入の尾静脈カニューレが挿入されます。第二に、小切開は内転筋コンパートメントの動脈のツリーを公開する鼠径部で行われました。超音波プローブに断面で筋肉を表示する対側上後肢で配置します。血管径の評価基準パラメーターを評価するために、マイクロバブル、筋血流と血管の血液量 (MBV) を推定する一定の速度で注入してその後。前に、応じて外因クランプの間に適用されると、IVM と CEUS の組み合わせは動脈径、微小血管筋灌流と全身のインスリン感受性インスリン誘発性変化の評価を許可します。さらに、微小循環の反応およびインスリン抵抗性動脈の時間的関係を定量化することができます。フォロー アップすることが可能、マウス縦の時間だ、血管や全身のインスリン感受性の変化を研究するための貴重なツールとなって
血糖値の上昇に対し、膵臓は血流がすぐに抵抗血管と毛細血管を介して、骨格筋などの標的臓器に分散にインスリンを分泌します。骨格筋は食後のグルコース取り込み1~ 80% を担当です。骨格筋の間質へのインスリンの配信は、律速段階のブドウ糖の処分2,3、4を促進インスリンの代謝活動に示されています。10-15 分以内は、インスリンは、毛細血管の血液量 (微小血管募集)、総血流量増加5,6前に発生する効果を増加します。微小血管募集栄養素 (とインスリン) の交換7,8で利用できる内皮表面領域を展開します。インスリンを介した血管募集の前に、独立して骨格筋糖取り込み8,9の変更に関連付けられています。インスリンの血管系に及ぼす影響は、’血管インスリン感受性」と呼ばれています。
インスリンを介した血管募集とインスリン依存性の血管拡張、肥満 Zucker ラット10,11で損なわれることが示されています。さらに、減らされた毛細血管密度と無駄のないマウスは、筋インスリン抵抗12を表示します。自分の影響力のある仕事、久保田らを示した血管内皮細胞におけるシグナル伝達障害のインスリン インスリン誘発微小採用で、約 4013によって骨格筋でのグルコース取り込みを減少の減少を引き起こした。血管機能のこれらの異常のみで発生しない筋肉、他の複数の組織や臓器、心臓などにも網膜や腎臓の14,,1516。これらの例と他の研究17,18,19,20インスリンの血管作用がインスリン抵抗性の (病態) 生理学で重要なメカニズムであることを示唆していると、合併症。
インスリンが微小血管の血液量 (MBV) 骨格筋5,6を増加する実質的な証拠がある、この問題が発生するメカニズムは完全に理解9ありません。内皮依存性血管拡張血管インスリン感度21,22,23血管系のさまざまなレベルでの多くの側面に不可欠です。血管のインスリン感受性でマニフェスト自体抵抗血管のインスリンによる弛緩、微小血管の灌流交換表面積7,24、増加する前毛細血管細動脈の緩和 25。
生体顕微鏡 (IVM) はさまざまなマウス28とハムスターの頬袋のマウス背部26、27のマウスおよびラットの腸間膜虚血肢のモデルの皮下脂肪のチャンバーを含むティッシュの準備で使用されています29. 造影超音波検査 (CEUS) は骨格筋31と同様、心臓30微小循環の評価ができる別のイメージング テクニック。Rheologically 赤血球として動作し血管の内腔内に完全に残る不活性ガス封入のマイクロバブルを使用しています。これらのマイクロバブルは、定常状態を達成するために一定の速度で静脈内に注入されます。高エネルギーの超音波を使用して、気泡を破壊すると、できます。マイクロバブルの補充速度領域 (ROI) では、流速 (MFV) を表します。コントラスト画像の全信号強度は、MBV を表します。CEUS は (人間) にも繰り返し実行することができ、(バレットらで説明したインスリン抵抗性の状態は、血管の機能不全の理解が進んだ32)。
現在の研究で筋灌流、IVM と CEUS の同時使用を規制を研究のための新しい技術について述べる。ここで、マウスの後肢筋内転筋コンパートメント内のインスリンの血管アクションに焦点を当てます。この区画は、代表的な筋肉ローカル糖代謝の研究を有効にするマウス最大の骨格筋肉グループのひとつです。この区画は、準備と動脈の可視化が容易にアクセスできる標準化された手術28IVM に最適です。また、私たち自身のグループとその他が、このコンパートメント33,34CEUS ことを示されています。
IVM と CEUS 術の利点は、大きい細動脈 (フィードまたは抵抗動脈) と同じ筋群における微小循環 (毛細血管ベッド) のレベルでのインスリンの効果を評価する可能性です。さらに、2 つのメソッドの同時アプリケーションは、抵抗血管の微小循環レベルでのインスリンの時空間行動に洞察力を提供します。これは IVM を組み合わせるし、CEUS 手法は他の血管生物学分野でも実装できます。たとえば、ノックアウト モデルを用いた様々 なタンパク質や血管内皮細胞に影響を与える特定の病態生理学的条件の役割を学ぶことができます。また、複数時点の時間と研究のコスト削減で 1 つのマウスで両方の方法を使用できます。
大きい動脈 (IVM を使用) と (CEUS 使用) 骨格筋の微小循環のインシュリンの血管操作を同時に推定する手法を開発しました。成功し、信頼性の高い測定の重要なステップは、: 1) 出血せず薄動脈を正しく公開します。2) 入浴動脈; パラフィン油の漏れを防止します。3) 投与による血管作動性化合物 (インスリン) および造影剤 (マイクロバブル) の特許静脈アクセス (尾静脈カニューレ) を持ちます。
筋障害の研究は肥満とインスリン抵抗性14,25,39,40のコンテキストで注目を得ています。肥満とインスリン抵抗性の血管機能の負の影響は、血管のツリーのさまざまなレベルで示されています。今後は、これらの変更を評価するために異なるアプローチが必要です。同じマウス IVM と CEUS テクニックの併用は、血管系のさまざまなレベルでのインスリンの効果を定量化するための強力なツールを提供します。IVM は、直接可視化と抵抗動脈の定量分析でき CEUS インスリンによる筋血流の変化の評価のため。
内転筋コンパートメントを勉強していくつかの利点があります。動脈は、容易にアクセス可能と切開の表面的な性質はそれに実験が完了したら 5.0 滅菌縫合で皮膚切開を閉じるすることが可能。動物は、0.1 mg/kg の用量で鎮痛剤として、実験後ブプレノルフィンを皮下注射され、暖かい環境でリカバリできます。マウスは、非常によく手順を容認し、我々 は動物の損失も 35 を超える動物は勉強で後肢の感染症を経験します。これは、フォロー アップすることができます。 または縦断的方法で動物を研究します。しかし、これらの実験に使用される動物は 1.8% 吸入イソフルラン麻酔マスクが 0.4 L/分で流れる酸素とのバランスを使用して麻酔されました。イソフルラン麻酔41,42と対照をなして FMA 麻酔は末梢のインスリン感受性を妨害しません。今後の予定は、マウスが FMA 麻酔から回復する方法も研究することです。
内転筋のコンパートメントは、ローカル仲介各種血管作動性化合物からも便利と下流の血管の効果を評価することができます。たとえば、標的組織にこれらの化合物の局所塗布は superfusion 技術28手術操作や周囲の血管43薬剤溶出カフスの注入を使用して実行可能です。さらに、薄動脈を分離し、圧力の第 1 報で勉強できます。当社グループは、他の人がこの動脈前のヴィヴォ36,37,38.に及ぼすインスリンと他の血管作動性物質を文書化する圧力の第 1 報を使用して相当な実験的証拠を集めています。
IVM の技術の使用に固有の制限は筋肉の手術博覧会、船舶を安定させるためにパラフィン油のアプリケーション。これらの操作に影響を与える動脈のネイティブ環境かどうかは不明です。ただし、図 3 aは、パラフィン オイルを浴びて薄動脈のベースラインの直径が大きく変化しないことを示しています。鉱物油が正常濃度条件44から組織を保護する、酸素の拡散を阻害することも示されています。さらに、油は動脈の基準径の変化を減らすのに役立ちます。だからこそ、パラフィン オイルを使用し、少なくとも 30 分間準備休ませて掲げました。注記のうち、オイル- またはないオイルの代わりにバッファーに格納された生理食塩水の使用は-非常に可変直径および容器 (データは示されていない) を圧迫することで結果。また、実験の最後に、パラフィン オイルを浴びて – 薄動脈を分離し、圧力の第 1 報でその反応をテスト前のヴィヴォ。パラフィン オイルを浴びて動脈反応同様にインスリンとアセチルコリン (血管拡張薬) で刺激したときの動脈を制御する (データは示されていない)。一貫性のあるインスリン依存性血管拡張反応は明らかに本 IVM プロトコルは、信頼性の高い結果を生成することを示します。
同じマウスの両方の技術を適用することの利点は、他の手法の 1 つの本質的な制限の一部を克服: 妨げられていない筋肉、体内CEUS 見積もり MBV が、個々 の船舶を見ることができない;IVM では MBV を推定できないとはいえ、個々 の船舶を見ることが可能。将来計画は、CEUS 対側の内転筋の挙睾筋の組み合わせでの IVM 顕微鏡を利用することです。この変更は、(使用 CEUS) MBV と直接光 (IVM を使用して) 毛細血管への推定を提供できます。プロトコルをさらに変更することができます。尾カニューレの使用 4 ウェイ コネクタは、5 ウェイ コネクタに切り替えることができます。これにより、我々 は (ポイント 2.9 で説明) 2 番目 CEUS 測定を実行しながら麻酔チューブをデタッチを避けることができます。我々 の経験では、マウスは現在のプロトコルを忍しました。このプロトコルを作ることができるもう一つの変更は、使用されるインスリン クランプ速度です。超生理的と考えられている 7.5 の mU/kg/分クランプ速度を使いました。研究によって低いインスリン クランプ率 (たとえば 3 mU/kg/min) を使用できます。
我々 は信頼性の高い説明プロトコルを発見した、注意を必要とする特定の制限があります。血管径の計測が最適でない場合があります。準備の手順を実行すると、モデルといくつかの経験が必要です。船の邪魔し、別の 30 分間、動脈の残りをさせる必要がある、直径を変更、新しいオイルを継ぎ足すことに、容器環境からパラフィン オイルが漏れていないことが重要です。また、パラフィン油の表面に (プロトコルの 1.14 の手順で説明) 光の反射が明るすぎる、動脈を表示するのには難しくありました。これはパラフィン油面と動脈と平行に斜めに光が落ちるように光源を指揮して相殺することができます。
結論として、本 IVM CEUS 技術の組み合わせの場合、血管系のさまざまなレベルでのインスリンの効果の違いを定量化することが可能になります。薄動脈の IVM CEUS を用いて下流の微小血管血流に貢献する上流の血管の変化への洞察力を提供します。我々 はより同じマウスにおける実験技術のいくつかの組み合わせは血管の機能を評価する支持者します。
The authors have nothing to disclose.
Ing に感謝いたします。本研究で用いた画像解析ソフトウェア (ImageGrabber) のプログラミングにダンカン ・ ヴァン ・ トヨタプリウス。この研究を提供するための資金調達からオランダ科学研究 (グラント 016.136.372) 機構のビディ助成金によって。
C57BL/6 Mice | Charles river | Mice used were bred in-house | |
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system | VisualSonics inc. | ||
MS250 non-linear transducer | VisualSonics inc. | ||
Vevo 2100 software | VisualSonics inc. | ||
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves |
Vortex | VWR international | 58815-234 | |
Heating pad | Pantlab | ||
Freestyle Precision Xceed | Abbott | To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp | |
Insulin Novorapid | Novo Nordisk | ||
Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1083421000 | |
Buffered saline solution | B. Braun | 152118062 | |
PE-20 medical tubing | Becton, Dickinson and Company | 427405 | |
Needle, 27 Gauge | Becton-Dickinson & Co | 305109 | |
Medical tape | 3M | ||
Ultrasound probe holder | Built In-house | ||
Cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
Creme depilator | Multiple Equivalent | ||
Gel tissue adhesive | Derma+flex | GA30005-2222 | |
Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
Small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Straight forceps with fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
Camera | Basler | scA1390-17gc | |
Image Grabber program | Built in-house | Image acquisition system | |
Timer | VWR | 33501-418 | |
Syringes, 1 ml | Fisher | 14-817-25 | |
Light source, fiber-optic | Schott | KL1500 | Ideally has adjustable arms |
Paraffin oil | Multiple Equivalent | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbubbles | |||
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
polyoxyethylene stearate | Sigma | p3440 | |
perfluorobutane gas | F2 Chemicals | C4F10(g) | |
Decon FS200 ultrasonic bath | Decon Ultrasonics Ltd | ||
Vialmix | Lantheus Medical Imaging | 515370-0810 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc |