Vi presenterer en metode for å oppnå sub-nanometer oppløsning med amplitude-modulasjon (tappe modus) atomic force mikroskopi i væske. Metoden er vist på kommersielle atomkraftmikroskop. Vi forklare begrunnelsen bak våre valg av parametere og foreslå strategier for oppløsning optimalisering.
Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user’s specific system.
Siden oppfinnelsen sin, tre tiår siden, har atomic force mikroskopi (AFM) en etablert seg som en teknikk av valget for å undersøke prøvene på nanonivå, spesielt der gjennomsnitt over makroskopiske flater er ikke mulig og lokal informasjon er nødvendig. I en typisk AFM måling, er nedbøyningen av en fleksibel cantilever benyttes for å kvantifisere interaksjonen kraften mellom et lite antall molekyler og en Ultra spiss montert på enden av braket. Avhengig av typen av interaksjoner og tidsrammene i betraktning, kan et bredt spekter av informasjon utledes, herunder de viskoelastiske egenskapene til myke biologiske membraner 2,3, styrken av et enkelt kjemisk eller molekylær binding 4,5, de atomiske detaljer om en flate 6 – 8, den magnetiske 9, kapasitive 10, gjennomfører 11, termisk 12,13 og kjemiske 14 egenskaper av prøvene <sup> 15. En del av suksessen til AFM er dens evne til å arbeide på et bredt spekter av materialer 16 og i flere miljøer som vakuum 17, gass 11,18 eller væske 19,20, fordi det ikke er avhengig av en bestemt kraft mellom sonde og prøve .
I praksis vil imidlertid, som opererer AFM til annet enn omgivelsesforhold kan være utfordrende og mange publiserte resultater fremdeles oppnås i luft. En ytterligere vanskelighet kommer fra det faktum at det vanligvis er nødvendig å operere AFM i dynamisk modus (vibrerende spiss) for å bevare både spissen og prøven ved å unngå store friksjonskrefter. Selv om mer utfordrende, kan dynamisk drift i prinsippet gi mer informasjon om prøven analysert, og uten tap av romlig oppløsning. I løpet av det siste tiåret, har feltet dynamisk AFM i flytende sett viktige utviklingstrekk, fra bruk av video-rate AFM 21 – 23, til flerfrekvensmålinger <sup> 24,25 og sub-nanometer avbildning av hydration strukturer på grensesnitt 26 – 31. AFM drift mens nedsenket i væske er nå rutinemessig brukt i biologi og biofysikk 32-36, polymer forskning 37, elektrokjemi 38-40 og solid væske grensesnitt karakterisering 41-44. Tilstedeværelsen av væske rundt den vibrerende cantilever endrer betydelig dens dynamikk 45 samt samspillet mellom spissen og prøven 29,42. Når den brukes på riktig måte, kan væsken utnyttes for å forbedre bildeoppløsningen 26,29, med en typisk forbedring av nesten en størrelsesorden i forhold til den beste oppløsningen oppnådd i omgivelsesbetingelser 46.
I AFM, den høyeste romlig oppløsning oppnåelig for en bestemt måling avhenger både av kvaliteten av AFM selv og arten av than interaksjon analysert 20,47,48. På det nåværende tidspunkt, mest high-end, kommersielt tilgjengelige AFMs dagens støynivå som er nær det av termisk grense 12 så den avgjørende faktor for oppløsning er vanligvis tip-prøven interaksjon. Det er effektivt den romlige gradient av dette samspillet som bestemmer vedtak: målinger basert på korte avstander, raskt råtnende samhandling produsere høyere oppløsning resultater enn når lengre rekkevidde interaksjoner er på spill. I væske, kan solvatisering krefter forbedre avbildning oppløsning fordi de har en tendens til å forsvinne i løpet av bare noen få molekylære diametere på væsken (typisk <1 nm) når det beveger seg bort fra overflaten av prøven 49. Disse krefter stammer fra interaksjonen mellom væskemolekylene og overflaten av prøven. En væske med en sterk affinitet for overflaten vil ha en tendens til å være mer ordnet og mindre mobile enn væskemassen ved grenseflaten med prøven 29,42,50. Som et resultat,det vil ta mer energi for en vibrerende AFM spissen for å fortrenge grenseflate flytende molekyler enn bulk væske 42, rende målingen svært følsom for lokale variasjoner i grenseflate flytende egenskaper på nanonivå -the desolvatiserende landskapet.
For å kunne utnytte solvatisering styrker, flere praktiske aspekter må tas i betraktning. Først oscillasjonen amplituden av spissen må være sammenlignbare med området for de solvatisering krefter, typisk <1 nm. For det andre, den væske som anvendes må danne en veldefinert oppløsnings landskap ved overflaten av prøven. Makroskopisk, er dette ekvivalent med å kreve en "fukting" væske for prøven vurderes. For eksempel, i vann, er det lettere å oppnå molekylært nivå oppløsning av hydrofil glimmer enn på hydrofob grafitt 42,51. Endelig må fjærkonstanten av braketstøtte spissen velges hensiktsmessig 52,53. Når du arbeider i disse condene, ikke AFM ikke bare gi molekylnivå av grenseflaten, men det utledes informasjon om de lokale prøve-væske affinitet som kan brukes for å få kjemisk informasjon om prøvens overflate 54.
De mest vanlige dynamiske driftsformer for AFM i væske er amplitude-modulasjon (AM, også "tappe mode ') AFM og frekvens-modulasjon (FM) AFM. I det første tilfellet 55, spissen raster-avsøker prøven mens dens vibrasjon amplitude holdes konstant ved hjelp av en tilbakekoblingssløyfe som kontinuerlig re-justerer tip-prøven avstand. Et topografisk bilde av prøven er hentet fra den korreksjon som utøves av tilbakekoblingssløyfen. I FM-AFM 28,41,56, er det oscillasjonsfrekvensen av braket / spiss som holdes konstant, mens spissen avsøker prøven. Begge teknikkene gir sammenlign topografisk oppløsning i flytende 36,57. Kvantifisering av tuppen-prøven interaksjon har en tendens til å være mer Straightforward og nøyaktig i FM-AFM, men AM-AFM er enklere å implementere, mer robust, og gjør det mulig å arbeide med mykere bommer, noe nyttig for å studere lett deformerbare eller ømfintlige prøver. Betydelig, er AM-AFM mer utbredt blant AFM brukere, blant annet av historiske årsaker, men også på grunn av det faktum at det er teknisk enklere å kontrollere.
Selv om amplitude holdes konstant ved hjelp av tilbakekoblingssløyfen i løpet av AM-AFM avbildning, blir faseforsinkelse mellom spissen oscillasjon og den drivende svingning tillates å forandre seg fritt. Fase-lag kan gi nyttig informasjon om tip-prøven interaksjoner, er relatert til energi utsvevende under svinging av tuppen på grensesnittet med prøven 58. Derfor fase-avbildning kan bli kjøpt samtidig for å topografisk bildebehandling, og er ofte komplementære i å synliggjøre mangfoldet i en prøveflate. Fase avbildning har vært benyttet for forskjellige kartlegging av interaksjoner, inkludert direct kartlegging av vedheft energi 42, viskoelastiske egenskaper 58 og hydrering landskapet i et grensesnitt 44.
I praksis å oppnå bilder med høy oppløsning i flytende forblir ikke-triviell på grunn av det store antall parametere for å kontrollere, og fraværet av en enkel, systematisk protokoll som virker i enhver situasjon. Bildekvaliteten avhenger typisk av størrelses cantilever geometri og elastisitet, spissen kjemi, oscillasjonen amplitude, og prøven stivhet, blant andre 55. AFM-målinger er også, ved definisjon, perturbative til systemet. Som et resultat, kan endring av avbildnings variabler og miljømessige forhold uten egnede hensyn føre til vanskeligheter i reproduserbarhet og / eller misrepresentative observasjoner og falske resultater.
Her presenterer vi vår protokoll for å oppnå høyoppløselige bilder av harde og myke prøver i løsningen, ved hjelp av kommersielle instrumenter som brukes i amplitude-modulasjon. Vårt mål er å tilby en praktisk fremgangsmåte for å optimalisere de viktigste parametrene egnet til å påvirke oppløsningen over forskjellige prøver, forklarer i hvert fall begrunnelsen for våre valg fra de fysiske prinsipper som ligger til grunn bildeprosessen. Vi detalj en steg-for-steg tilnærming, fra underlaget rengjøring og klargjøring, til valg av cantilever, justering av bildeparametere og feilsøking vanlige problemer. Å forklare den vitenskapelige begrunnelsen bak våre valg og prosedyrer for høy oppløsning bør bidra til å gjøre rasjonelle valg når tilpasse metodikk, og fungere som et utgangspunkt for bildebehandling nye systemer.
I denne teksten bruker vi AM å referere til amplitude-modulasjon drift som en AFM. Vi viser til tilbakemeldinger parameter holdt konstant under enten cantilever nedbøyning (kontaktmodus) eller oscillasjon amplitude (AM-modus) som børverdien. I AM modus er cantilever eksternt drevneenten ved hjelp av en akustisk oscillasjon eller av en pulset laser fokusert på undersiden av braket. Stasjonen amplitude er intensiteten av det ytre oscillerende signal. Den absolutte verdi av driv amplitude som kreves for å oppnå en gitt amplitude svingning av braket avhenger av mange parametere så som metoden for kjøring (akustiske, fototermiske eller magnetisk), cantilever fiksering og parametre (stivhet, geometri) og laser justering. Den nøyaktige verdi av driv amplituden er derfor ikke relevant, men det er tilpasset i hvert forsøk, slik som å tilveiebringe en passende (og kvantifiserbare) oscillasjon amplituden av braket. Når den drevne cantilever er langt borte fra prøven, og ingen dempning av dens vibrasjon foregår gjennom tipp-prøvevekselvirkninger, er dens svingn amplitude kalles den frie svingning amplitude. Som den vibrerende spiss nærmer seg overflaten av prøven, starter sin amplitude for å minke. Hvis tilbakemeldingene er aktivert, vil z-piezo Constantly re-justere sin utvidelse, slik at til kjølen valgt nominell verdi amplitude, konstant. Børverdien er normalt alltid mindre enn den frie amplitude. Det er vanlig å referere til børverdien forhold, forholdet mellom innstillingsverdien amplitude (avbildning amplitude) over den frie amplitude. Jo mindre nominell verdi ratio, strengere imaging forholdene er.
Forutsatt at bilde væske og cantilever stivhet har valgt riktig, de mest kritiske trinnene for å oppnå vellykket med høy oppløsning er justering av bilde amplitude, og den generelle renslighet av undersøkte systemet.
Amplituder kan sammenlignes med tykkelsen av grenseflate flytende område (typisk mindre enn 2 nm) sonder hovedsakelig variasjoner i egenskapene til grenseflate-oppløsningsmiddel 42. Dersom oscillasjonen amplituden er for stor, vil den vibrerende spiss traversere langtrekkende, ikke-lineære kraftfeltene 52 som utelukker stabiliteten av cantilever bevegelse, og uunngåelig treffer prøven uavhengig av de bildedannende betingelser 29, noe som resulterer i forringelse av oppløsningen. Bortsett fra tapet i oppløsning, høyere harmoniske begynner å vises i spissen bevegelse og systemet blir mer komplisert å modellere 55. Alternativt, dersom avbildnings amplituden er for liten oare del av grenseflaten blir analysert (typisk spesifikk lag av grenseflate-væske) og stabil avbildning kan bare oppnås med stive bommer (> 10 N / m i vann 53) for et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold, med risiko for skadelige myke prøvene enn store høydevariasjoner. Behovet for stive bommer er å overvinne den termiske støyen som kan bli mer betydningsfullt at signalet målt Når du arbeider med små amplituder, de langtrekkende interaksjoner mellom spissen og prøven er fortsatt til stede, men er stort sett konstant og påvirker ikke høy oppløsning og kontrast i bildene innhentet.
Renslighet av bildebehandlingsmiljøet er av avgjørende betydning når det gjelder høy oppløsning AFM. Uønskede stoffer i systemet kan interferere med både avbildning og kraften spektroskopi. Det er to hovedkategorier av forurensninger som har en tendens til å påvirke forsøkene: (i) forurensninger direkte synlig når avbildning ( <strong> Figur 4B, 4C) og (ii) generell uforklarlig mangel på høy oppløsning. Sak (i) har en tendens til å oppstå bare i svært idealiserte systemer som på vann glimmer grensesnitt der adsorberte molekylære aggregater som forstyrrer tupp-sample interaksjoner er tydelig kontrast mot atomically flat glimmer overflaten (Figur 4A). Før du endrer spissen og prøven, er det verdt å anskaffe spektroskopiske kurver med et stort utslag, effektivt trykke hardt tuppen mot prøven gjentatte ganger. Dette vil normalt ødelegge en ny spiss, men kan av og til rense en skitten tips eller indusere stabile hydration områder egnet for bildebehandling. Denne spiss vil imidlertid uunngåelig bli avstumpet og følgelig bare være egnet for flat prøve, selv om den forbedrer bilde. I tilfelle av mistanke om forurensning i løpet av stive prøver, kan det være verdt å prøve å bilde med den andre eigenmode av braket før forsøker den noe destruktive fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Dette krever bare swkløe kjøre frekvens til andre eigenmode og omstille amplitude / nominell verdi (se feilsøking omtale nedenfor). Den effektive stivhet i cantilever øker betraktelig når opererte på andre eigenmode og noen svakt adsorbert forurensninger kan skyves vekk av tuppen mens bildebehandling. Denne strategien erstatter ikke behovet for en ren prøve og tips, men har noen flere veier for å skaffe tilfredsstillbilder når en spiss / prøven er helt klart ikke ideelt.
Figur 4: Eksempler på forurensning følges ved avbildning muskovitt glimmer som hemmer høy oppløsning imaging. A: Mica avbildes i 5 mM RbCl – ingen forurensende partikler er synlige. B: Forurensning tar form av aggregater i størrelsesorden titalls nm over mens bildebehandling i nominelt ultrarent vann. C: Selv montert strukturer dannet av contamiNant partikler antagelig amfifile i naturen. Imaging ble igjen gjennomført i nominelt ultrarent vann. D: vertikalt forskjøvet seksjoner svarende til de stiplede linjer i A, B og C som viser avviket fra glimmer s atomisk flat overflate. Skala barer i A, B og C tilsvarer 300 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Sak (ii) er mer vanlig og kjennetegnes hovedsakelig ved frustrerende faktum at sub-nanometer funksjoner rett og slett ikke kan løses uavhengig av imaging forhold. Undertegning av denne typen situasjon er vanligvis synlig i kraft spektroskopi måling som har en tendens til å vise noen uoverensstemmelser. Disse kan omfatte dårlig reproduserbare kurver og amplitude vs avstand kurver som avviker vesentlig fra et typisk sigmoidal form 42. Hvis forurensninger, ioniske eller på annen måte, er dispersed homogent gjennom væsken, kan de ikke vises i topografisk bildebehandling, men kan forstyrre hydrering strukturen av prøven 69, noe som er avgjørende for å opprettholde en vanlig tip-prøve interaksjon 29 og oppnå høy oppløsning 70. Det kan også være direkte effekter av forurensninger på prøven, spesielt i myk, biologiske eksperimenter. For eksempel er det vel kjent at nærvær av alkoholer (fra renseprosedyre) kan fluidify gel-fase lipidbilag 71 – 73, slik at sub-nanonivå oppløsning umulig. Hvis høy oppløsning ikke er mulig, bør man være først tatt i renseprosessen, med fokus spesielt på alt utstyr som kommer i kontakt med bildeoppløsning. Selv tilsynelatende stabile forbindelser slik som epoksyharpiks, kan solvatisere i væsken til en viss grad om ikke fullstendig herdet.
Høyoppløselig avbildning med AM-AFM er krevende, krever tålmodighet ogofte flere forsøk før de når best mulig bilde forhold. Små eksperimentelle problemer kan lett bli viktig nok til å hindre høy oppløsning og feilsøking ferdigheter er avgjørende. Heretter vil vi liste noen av de vanligste problemene vi med vårt forslag til løsning.
cantilever tuning
De fleste kommersielle AFMs bruke akustisk eksitasjon å drive cantilever. I et slikt tilfelle innstiller cantilever, som beskrevet i trinn 5.4, i nærheten av dens resonansfrekvens gir ofte tilstrekkelig ytelse for drift i luft. I flytende miljøer, har en tendens til væsken for å indusere noen kopling mellom de forskjellige mekaniske deler av AFM som cantilever-brikken og holderen. Dette kan påvirke den tilsynelatende resonans av braket, ofte illustrert ved hjelp av et cantilever frekvensspektrum som oppviser mange skarpe topper og daler som vanligvis beskrives som en "skog av topper". Som et resultat, er det ofte vanskelig å finne den tilsvarct kjøretur frekvens. Disse topper eksisterer også i gassmiljøer, men på grunn av den høye verdien av kvalitetsfaktoren av cantilever er amplituden ved resonans er betydelig større 74,75. I flytende velge den riktige topp for å drive cantilever kan være ikke lett, og kan kreve prøving og feiling. I praksis er det frekvenstopp med bratteste variasjon i amplitude i "skog av toppene" rundt resonansfrekvensen er vanligvis det beste alternativet tross for at det ikke nødvendigvis er nøyaktig på resonans og ofte gir en drivende frekvens tilstrekkelig for å oppnå høy oppløsning avbildning.
bildeforvrengning
Imaging drift er ofte et problem når du søker med høy oppløsning og gjør at bildene ser forvrengt (typisk strukket). Dens opprinnelse er vanligvis termisk, enten fordi skanner / AFM ikke har nådd likevekt driftstemperatur, eller fordi en del av prøven væsken fordamper raskt (for eksempel bildebehandling i alkoholer ). I alle tilfeller, blir driften ubetydelig ved termisk likevekt. Det er derfor nyttig for å fastsette temperaturen i prøven hvis det er mulig. Ellers er det verdt å forlate AFM til å skanne en blindprøve (stor størrelse scan på slow scan rate) i flere timer før du utfører forsøket. Hvis fordampning er ikke et problem, er denne prosedyren gjøres best etter trinn 6 i prosedyren, ta vare å først trekke spissen kort avstand (for eksempel 20 mikrometer) fra overflaten. Noen ganger vil de strømningene forbli selv etter omfattende termalise. Dette betyr vanligvis at cantilever eller sin chip er delvis dra prøven mens imaging, noe som kan skje på myke sammenhengende prøver slik som tynne filmer eller hvis spissen / cantilever / chip er ikke hensiktsmessig plassert. På chips som er vert for mer enn en cantilever / tips, er det ofte nyttig å bryte cantilever som ikke er i bruk i stedet for å la dem dra over overflaten.
ionestyrke
ntent "> Siden bildebehandling er dominert av grenseflate væske, er det noen ganger nyttig å legge litt salt for høyoppløselig avbildning av ladet overflate i vann. Rollen til salt er todelt. For det første, endrer det hydrering landskapet i overflate avbildes ved adsorpsjon, noe som ofte øker kontrasten. for det andre hjelper det skjerm sterke elektrostatiske vekselvirkninger mellom spissen og prøven (for eksempel på glimmer). Generelt større ioner, kalium, rubidium og cesium tillate bedre bilder på grunn av deres spesifikke hydrering egenskaper 76, og det faktum at de ofte adsorberes i hovedsak i et unikt hydrering tilstand 77.Bad cantilever / tips
Hvis det er mistanke om at cantilever er en kilde til forurensning (se symptomer som beskrevet ovenfor), må det først kontrolleres under et optisk mikroskop. Hvis lagret i en gel-boksen, kan cantilever plukke opp spor av gel polymerer eller silikonolje 59 som kan vises, I ekstreme tilfeller, som mørkere flekker, på baksiden av braket (som i figur 5A). Photothermal svinging av cantilever kan indusere lignende flekker, men de er på grunn av nedbrytning / overoppheting av cantilever belegget ved kjøring laser. Forurensning tendens til å vises tilfeldig på cantilever. En lengre (12 timer) rensing med isopropanol og, deretter, med ultrarent vann kan fjerne eventuelle uønskede partikler fra cantilever.
Figur 5: Sammenligning mellom en ny cantilever og en identisk en som har vært i utstrakt bruk på harde flater, og igjen i en gel boks for en lengre periode. A: Top; optisk bilde av splitter nye cantilever som har blitt renset (se prosedyre). Bunn; optisk bilde som viser utseendet på synlig forurensning (blå pil) fra gel-boksen. B: Sammenligning av bommene respektive termisk spektra.Utvidelse av den gamle cantilever første resonanstoppen er klar (grønn pil) og noen høyere orden moduser er forbedret (blå pil). Spectra er vertikalt forskjøvet og presentert på en log-log skala for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hvis nødvendig sub-nanometer oppløsning ikke er oppnådd, til tross for akseptable bilder med lavere oppløsning, er det mulig at AFM spissen har blitt kjemisk modifisert i løpet av sin lagringsmiljøet. Dette kan behandles ved eksponering av cantilever-brikke med et ultrafiolett oksydasjonsmiddel for 120 sekunder, som hjelpemidler etablering av hydrofile overflategrupper på spissen 60. Forsiktighet bør utvises men som den eksakte tiden som er nødvendig kan variere avhengig av tips geometri og UV makt, og overeksponering kan føre til blunting av tuppen og redusert oppløsning.
Termisk støy </ P>
Høyoppløselig avbildning krever stor følsomhet for variasjoner i kraft og avstander (typisk sub-PN krefter og sub-Ångström distanserer 78). For mykere utkraginger, kan den termomekaniske bevegelse av braket på grunn av sin iboende Brownske bevegelser (termiske vibrasjon) være et problem. I første tilnærmelse, med en utligger av stivhet k, er det ikke mulig å måle inneholder mindre enn Er amplituden av den termiske støy, hvor k B er Boltzmanns konstant og T er temperaturen. I praksis, ved hjelp av cantilever med høyere resonansfrekvenser sprer støy over et større frekvensområde, og reduserer den totale støynivået i målebåndbredden 79.
Høyere eigenmode bildebehandling
Det kan noen ganger være nyttig å operere den frittbærende ved sin andre eigenmodepå grunn av økningen effektive stivhet (se diskusjon av forurensning). I praksis gjøres dette ganske enkelt ved å kjøre den cantilever ved sin andre eigenmode (den andre resonanstopp ved høyere frekvens, se figur 1A). Når tuning cantilever, velger du bare andre eigenmode i stedet for hoved resonans og fortsett til trinn 5.4. Legg merke til at InvOLS vil være forskjellig når braket drives med den andre eigenmode; vanligvis ~ 1/3 av de InvOLS målt i trinn 5.2 for en rektangulær cantilever.
Den viktigste begrensning av teknikken er at det krever en stabil oppløsnings landskap ved overflaten av prøven. Prøven bør være robuste nok til å tillate å perturbere den grenseflate-væske uten å indusere vesentlig deformasjon av prøven i seg selv. Dette kan være utfordrende på veldig myke og ustabile prøver så store biomolekyler. I tillegg, liten amplitude AFM som beskrevet her kan ikke få mekanisk informasjon om pEGENSKAPER av en prøve, som cantilever spissen tilbringer mesteparten av sin tid i grense væske. For dette, kan det være fordelaktig å bruke andre tilnærminger som Kvantitativ Nanomechanical Mapping 80 eller gjøre bruk av høyere harmoniske av cantilever bevegelse. Høyere munnspill blir generelt forbedret ved avbildning i væsken (med lav kvalitetsfaktorer) 29,81 – 83, og kan gi samtidig topografi og stivhet av prøver 25,81 – 84, men de er generelt skadelige for høy oppløsning. Andre begrensninger som finnes i alle scanning probe mikroskopi teknikker er fortsatt gyldige her, spesielt det faktum at resultatene nødvendigvis inneholde informasjon om målespissen. Bruken av små amplituder er heller ikke ideelt for prøver med store høydevariasjoner; tilbakekoblingssløyfen vil uunngåelig reagerer mer langsomt når høyde variasjonene er større enn det bilde amplitude, således risikere prøven og spiss skade. Bruken of mykere cantilever begrenser dette problemet til en viss grad.
Hovedfordelen ved fremgangsmåten som presenteres her er det faktum at det gir den høyeste bildeoppløsningen mulig med AFM i væske, men kan implementeres på en hvilken som helst kommersiell AFM, forutsatt at støynivået til maskinen er lav nok. Sammenlign oppløsning på kommersielle instrumenter oppnås vanligvis i kontakt modus, eller av og til i FM-AFM med stiv bom. Arbeid i AM-modus og med relativt myke bom åpner for et bredere utvalg av prøver, og er enklere å implementere enn FM-AFM på de fleste systemer. Fremgangsmåten baserer seg på å utnytte solvatisering kreftene som eksisterer ved grenseflaten mellom en hvilken som helst faststoff og væske for å forbedre oppløsningen og få lokal kjemisk informasjon. Det kan i prinsippet brukes i omgivelsesbetingelser, stole bare på de vannlag (vanligvis flere nanometer tykke) bygger opp på de fleste overflater på grunn av luftens fuktighet. Prinsippene som ligger til grunnhøyoppløselig strategi ligger fast, men de fleste av spissen er i luft, med bare en kapillær bro mellom spissen apex og prøven 85. Høy oppløsning er vist på stive prøver i disse forholdene 86,87. De bildedannende betingelser er imidlertid annerledes enn i de nedsenket flytende på grunn av en høyere Q-faktor av braket sin oscillation. Praktisk talt, fant vi det vanskelig å oppnå stabil drift i løpet av myke eller uregelmessige prøver, antagelig på grunn av tidsmessige endringer av kapillær broen og økt Q-faktorer for et gitt cantilever stivhet.
Protokollen er beskrevet her har en metodikk for å oppnå molekylær nivå oppløsning av prøver i flytende med de fleste moderne kommersielle AM-AFMs. Vi gir den vitenskapelige begrunnelsen bak vårt valg av bildeparametere og legger vekt på solvatisering krefter. Vi har også diskutere felles problemstillinger og spesielt forurensning. De spesifikke tip-prøven interaksjoner can varierer betydelig avhengig av innholdet av det tenkelig løsning, cantilever geometri og materiale, og prøven kjemi. En praktisk forståelse av naturen av de dominerende kreftene tilstede under skanning er derfor viktig å tilpasse denne protokollen til nye systemer og sikre pålitelige resultater. Når optimalisert, er den eksperimentelle tilnærming kraftig for å få in-situ lokale molekylært nivå innsikt av prøver i løsningen.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra Engineering og Fysisk Sciences Research Council (tilskudd 1.452.230 og EP / M023915 / 1), bioteknologi og Biological Science Research Council (gi BB / M024830 / 1) og Det europeiske råd (FP7 CIG 631 186) er takknemlig anerkjent.
Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
Lipids | Avanti polar lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
Crystals | MTI | polished crystals | |
Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |