Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
Vi presenterer to minimalt invasive mikrokirurgisk teknikk i gnagere for spesifikk levering av legemidlene i mellomøret, slik at den kan nå det indre øret. Den første prosedyren består av perforasjon av tromme bulla, betegnes bullostomy; den andre er en transtympanic injeksjon. Både ligne menneskelige kliniske intratympanic prosedyrer.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) og Ringer's Laktat buffer (RL) ble brukt som biokompatible kjøretøy for lokal levering av legemidler. CGP er et ikke-toksisk biologisk nedbrytbar polymer som er mye brukt i farmasøytiske anvendelser. Det er en viskøs væske ved romtemperatur, men den blir stiv til en halvfast fase ved kroppstemperatur. RL er en isotonisk løsning som brukes for intravenøs administrering hos mennesker. Et lite volum av denne bilen er nøyaktig plassert på det runde vindu (RW) nisje ved hjelp av en bullostomy. En transtympanic injeksjon fyller mellomøret og tillater mindre kontroll, men bredere adgang til det indre øret.
<p class = "jove_content"> Sikkerhetsprofilen for begge teknikkene ble studert og sammenlignet ved hjelp av funksjonelle og morfologiske tester. Høring ble evaluert ved å registrere Auditory hjernestammen Response (ABR) før og gjentatte ganger etter mikrokirurgi. Den cytoarchitecture og bevaring nivået av cochlea strukturer ble studert av konvensjonelle histologiske teknikker i paraformaldehydfiksert og decalcified cochlea prøver. Parallelt ble det ufikserte cochlea prøver tatt, og umiddelbart frosset for å analysere genekspresjonsprofiler av inflammatoriske markører ved kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR).Begge fremgangsmåter er egnet som medikament-tilførselsmetoder, og i mus mellomøret, selv om transtympanic injeksjon viste seg å være mindre invasiv i forhold til bullostomy.
Nedsatt hørsel er den hyppigste menneskelige sanse underskudd og rammer 5,3% av den verdensomspennende befolkningen, og 30% av personer over 65 år ( http://www.who.int/topics/deafness/en , oppdatert 2016). Hørselstap påvirker språktilegnelse hos barn og akselererer kognitiv svikt hos eldre mennesker. Derfor er det et betydelig helsevesenet problem med en enorm samfunnsøkonomisk effekt. Det kan være forårsaket av genetiske defekter, miljøfaktorer eller en kombinasjon av begge deler 1, som til slutt forårsake skade og død av hårceller og nevroner i sneglehuset. Disse cellene ikke regenerere hos pattedyr, derfor cellular tap og samtidig hørselstap kan ikke reverseres. Kliniske alternativene er basert på proteser, inkludert høreapparat og cochlea, mellomøret og benlednings implantater 2. Dessverre er det ingen spesifikk medisinsk restorative treareksjonene for nedsatt hørsel og dermed flere forskningslinjer er fokusert på utvikling av forebyggende og reparerende behandling. Nye terapeutiske alternativene inkluderer gen og celleterapi samt utvikling av små molekyler for farmakologisk behandling to.
En av de viktigste utfordringene i cochlea-farmakologisk behandling er levering av legemidler. Systemiske behandlinger har begrenset effektivitet i sneglehuset på grunn av blod-labyrinten barrieren 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlea blodkar, som virker som en fysisk og biokjemisk barriere for å opprettholde det indre øret væske homeostase, derfor begrenser medikament passasje til det indre øret. Det er permeabel kun for små liposoluble molekyler, selv om permeabiliteten kan økes i løpet av sneglehuset betennelse, og også ved bruk av diuretika eller osmotiske midler. Volumet av stoffet som til slutt når cochlea etter systemisk administrasjon er redusert;Derfor er høye doser som kan forårsake organisk toksisitet nødvendig. I tillegg kan hepatisk metabolisme av legemidlet produsere giftige eller inaktive metabolitter 4, 5, 6, 7. I motsetning til dette lokale inngrep tillate plassering av et visst begrenset mengde av medikamentet inn i den midtre eller indre øret uten uønskede bivirkninger 4, 7, 8, 9. I klinisk praksis er intratympanic administrasjoner begrenset til visse cochlea patologi, som gentamicin i Ménières sykdom 10, kortikosteroider i plutselig døvhet, Ménières sykdom, immun-mediert og hørselstap, 11, 12, 13, 14, 15 og insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF1) i plutselig døvhet 4, 16, 17.
Formuleringer for lokal administrasjon bør bevare den skjøre homeostase (pH og osmolaritet) av cochlea væsker. I tillegg er det meget viktig å opprettholde sterilitet under hele prosessen for å unngå bakteriell forurensning av cerebrospinalvæske. Eksipienten anvendes for medikamentavgivelse bør være biokompatibelt, nonototoxic og av den passende konsistens. Flytende løsninger er anbefalt for intracochlear injeksjoner, men er ikke egnet for den intratympanic rute på grunn av klaringen gjennom øretrompeten. I dette tilfelle blir stoffene vanligvis båret av halvfaste geler for å øke deres varighet i mellomøret 4, 18, 19. Alternative levering systems brukes som bærere for å øke passasje av stoffet til det indre øret er nanopartikler 20 og adenovirus 21 Her har vi sammenlignet to biler: CGP og en RL løsning. CGP er en hydrogel dannet av kitosan, et lineært polysakkarid bestående av D-glukosamin og N-acetyl-D-glukosamin oppnådd fra krepsdyrskall og β-glycerofosfat, en polyol som danner et skjold av vann rundt kitosan kjedene og holder den i flytende form. CGP er termo og kan bli degradert ved lysozymer, slik at en vedvarende medikamentfrigjøring i mellomøret 22, 23, 24, 25. Chitosan-base-hydrogeler er egnede bærere for kliniske anvendelser slik som medikamentavgivelse på grunn av deres manglende immunogenisitet og mangelen på aktivering av lokale inflammatoriske reaksjoner 23, 24. På otheh hånd, er RL-buffer et ikke-pyrogent isotonisk løsning (273 mOsm / liter og pH-verdi 6.5) ment for intravenøs administrering hos mennesker som en kilde av vann og elektrolytter, spesielt i blodtap, traumer eller brannskader fordi biprodukter av laktatmetabolismen i leveren motvirke acidose.
Her beskriver vi og sammenligne to kirurgiske metoder som har blitt raffinert for lokal levering av legemidler til muse indre øret. Sikkerhetsprofilen til begge teknikkene ble evaluert ved hjelp av funksjonelle, morfologiske og molekylære tester. Høring ble evaluert med Auditory hjernestammen Response (ABR) 26, 27 utført før og etter mikro til forskjellige tider. End-point prosedyrer ble brukt til å dissekere sneglehuset og sammenligne den anatomiske, cellulært og molekylært virkningen av disse to mikro prosedyrer.
Lokal levering av legemidler til det indre øret kan gjøres direkte av intracochlear injeksjon eller indirekte ved intratympanic administrasjon, plassere stoffet i mellomøret 4, 19, 39. Intracochlear administrasjon gir kontrollert og presis levering av legemidler til sneglehuset, unngå diffusjon gjennom vinduet membraner, basal-til-apikal konsentrasjons gradienter og klaring gjennom øretrompeten. Imidlertid er det vanligvis en meget invasiv prosedyre som krever en kompleks og delikat mikro 7, 39. I denne sammenheng er næringen utvikle nye, belagt, implanterbare enheter for vedvarende legemiddeldosering 40, 41. På den annen side, er intratympanic administrering kan en minimalt invasiv og lett å utføre fremgangsmåten som tillater injeksjon av større mengder av Drug inn i mellomøret, selv om farmakokinetikk er ikke lett å kontrollere. Flertallet av medikamentet frigjøres gjennom øretuben og den gjenværende fraksjon har til å diffundere gjennom membranen RW for å nå sneglehuset 18. RW er stedet for maksimal absorpsjon av stoffer fra mellomøret inn i perilymph fylte trommekanal cochlea 7. Det er en halvgjennomtrengelig trelagsstruktur, selv om dens permeabilitet er avhengig av narkotika egenskaper (størrelse, konsentrasjon, løselighet og elektrisk ladning) og på trans transportsystemer (diffusjon, aktiv transport eller fagocytose) 42. Den ovale vinduet og otic kapsler er alternative, men mindre effektive innganger til cochlea 43, 44.
Her viser vi og sammenligne to mikro metoder for målrettet levering av legemidler i musen mellomøret: bullostomy og transtympanic injeksjonsprosedyrer. Vanlige kritiske trinn i disse fremgangsmåtene omfatter: i) en evaluering av hørsel før og etter mikrokirurgi, ii) fremstilling av en homogen kjøretøy oppløsning under sterile betingelser, iii) nøye overvåkning av anestesiprosedyre og overvåkning av dyrekroppstemperatur og konstanter, iv ) langsom plassering av riktig volum bærer rettet mot RW, og iv) tar cochlea prøver å fullføre molekylære og morfologiske analyser.
Retroauricular og ventral tilnærminger for bullostomy har blitt beskrevet 7, 45. Vi brukte ventral tilnærming fordi vår erfaring har resultert i mindre sykelighet og gitt bedre tilgang til RW 46. Transtympanic injeksjoner er vanligvis utføres gjennom pars TENSA av trommehinnen, anterior eller posterior til hammeren manubrium 12. IDette arbeidet utførte vi en modifikasjon av teknikken, en injeksjon gjennom pars flaccida utenfor hammeren med en foregående ytterligere punktering av pars Tensa for å tillate luft evakuering under injeksjon.
Den transtympanic injeksjon var mindre invasiv enn bullostomy, selv om begge microsurgeries var rask (20 og 5 min per øre for bullostomy og transtympanic tilnærming henholdsvis), med korte postoperative rekreasjon ganger og ingen sykelighet. Viktigst, begge prosedyrene vedlikeholdes hørsel og ABR-parametere var identiske med de som ble bestemt før den mikrokirurgi. Den transtympanic tilnærmingen tar mindre tid enn den bullostomy og kan utføres i begge ørene av samme dyret i løpet av den samme intervensjon. Fordeler med den transtympanic injeksjon er således at den kan utføres bilateralt og gjentatt om nødvendig. På den annen side, gir bullostomy direkte visuell adgang til RW membranen og tillater Filling av RW nisje. I kontrast, ikke transtympanic injeksjon ikke tillate for kontroll av kjøretøy plassering i RW nisje.
Prosedyrene rapportert i dette arbeidet beskriver hvordan du utfører en lokale stoffet kjøretøy levering til mellomøret for pre-kliniske applikasjoner som for eksempel evaluering av ototoksisitet og evaluering av effekt i hørselstap. To mikrokirurgi fremgangsmåter er beskrevet som gir alternative metoder med spesielle fordeler og ulemper. Både bevare hørselen og ikke forårsake morfologiske forandringer. Lokal betennelse er beskrevet som en potensiell komplikasjon av bullostomy. Et sett med komplementære teknikker er også beskrevet for postsurgical prosedyrer, inkludert hørsel, morfologiske og inflammatoriske markør uttrykk evalueringer. Fremtidige søknader om disse teknikkene inkluderer prekliniske evaluering av nye behandlingsformer for hørselstap, inkludert genetiske, cellulære og farmakologiske tilnærminger, i dyremodeller. Intratympanic Sjefioner sikre levering av behandlingen i mellomøret, i kontakt med det runde vindu membranen, lette passasje inn i perilymph uten tydelig skade sneglehuset.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Genomics og invasiv Neurofunctional evalueringstjenester (IIBM, CSIC-UAM) for deres tekniske support. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av den spanske "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) og Den europeiske union (FP7-AFHELO og FP7-PEOPLE-TARGEAR) til IVN.
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |