حمل إصابة نقص التروية ضخه في الجلد الأذن ماوس لحيوي داخلي Multiphoton التصوير من الاستجابات المناعية
Summary
يصف هذا البروتوكول تحريض نموذج نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) على الجلد الأذن الماوس باستخدام المغناطيس لقط. باستخدام نموذج التصوير حيوي داخلي مبنية خصيصا، ندرس في الاستجابات الالتهابية الجسم الحي بعد ضخه. الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية هو توسيع نطاق فهم كيفية استجابة الكريات البيض إلى إصابة الأشعة تحت الحمراء الجلد.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
تحدث إصابة نقص التروية ضخه (IRI) عندما يكون هناك نقص الأكسجة عابرة بسبب انسداد تدفق الدم (نقص التروية)، يليه إعادة الأوكسجين اللاحق للأنسجة (ضخه). في الجلد، ويعتقد أن نقص التروية ضخه (IR) ليكون واحدا من العوامل التي تسهم في الفيزيولوجيا المرضية لقرحة الضغط، حيث الراحة في الفراش لفترات طويلة يهيئ المرضى في المستشفيات على المدى الطويل للإصابة. في هؤلاء المرضى، ويتعرض كل من الجلد والعضلات الأساسية باستمرار للضغط الوزن المبذولة على مناطق من بروز عظمي، مما أدى إلى وقوع إصابات المترجمة التي، إذا ما تركت دون علاج، يمكن أن تصبح نخرية 1.
الأضرار تشارك في المعهد الجمهوري الدولي ذات شقين. خلال نقص التروية، وانسداد الأوعية الدموية يؤدي إلى انخفاض حاد في وصول الأكسجين إلى الأنسجة. وهذا يؤدي إلى انخفاض ATP ودرجة الحموضة، والذي يعطل ATPases تشارك في الأيض الخلوي. بدوره، مستويات الكالسيوم الخلوية السنبلة، وأكدت أو ألحقت أضرارا جملتعلمي اللغة اإلنكليزية الخضوع موت الخلايا المبرمج أو نخر 2. الافراج عن محتويات الخلايا أو الضرر المرتبطة أنماط الجزيئية (الخام)، مثل HMGB1، ويسهم في الاستجابة الالتهابية 3. وتحدث هذه الإهانة الثانية خلال ضخه. على الرغم من أن تتم استعادة مستويات الأوكسجين ودرجة الحموضة أثناء ضخه، وهذا يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الأمر الذي يؤدي إلى أكسدة الدهون داخل الخلايا، والحمض النووي، والبروتينات. ونتيجة لذلك، يتم تنشيط وسطاء الموالية للالتهابات، والذي ينطلق من الاستجابة الالتهابية الثانوية ينطوي على تجنيد الخلايا المناعية لموقع التهابات 2. في حين أن سلسلة من الأحداث البيوكيميائية التي أدت إلى استجابة التهابية وصفت بشكل جيد، والتنظيم المكاني والزماني للأنشطة الخلايا المناعية ليست مفهومة جيدا.
هنا، نحن تصف نموذج IR قوي على الجلد الماوس الأذن باستخدام بسيط المغناطيس لقط. إلى جانب التصوير multiphoton حيوي داخلي (MP-IVM)، ونحنأقامت نموذجا للدراسة في الجسم الحي الاستجابات الالتهابية التي تحدث بعد يأخذ ضخه مكان. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو محاولة لفهم كيفية استجابة كل من خلايا الخلالية والتسلل إلى الأشعة تحت الحمراء في الوقت الحقيقي.
النماذج الحالية من الأشعة تحت الحمراء باستخدام تقنية تحامل على الجناح الجلد هي الغازية للغاية، كما أنها تتطلب زرع جراحيا من ألواح الصلب في الجهة الجلد، مما يجعلها أقل من مثالية للدراسات المناعية 4. وقد وصفت تقنية تحامل غير الغازية مماثلة في 5،6 الماوس الجلد الجناح. ومع ذلك، بسبب إدراج عنصر التصوير حيوي داخلي في هذه الطريقة، ونحن بدلا من ذلك اختارت الجلد الأذن كموقع الأشعة تحت الحمراء المستهدفة، كما تلتف الحركات بسبب التنفس ويوفر الاستقرار أثناء التصوير 7،8. وعلاوة على ذلك، مجموعات فرعية الكريات البيض التي تمتد الخلالي متطابقة بين الجلد الأذن والجهة الجلد، على الرغم من أنقد تختلف الأرقام والنسب قليلا 9. وبالتالي، يمثل الجلد الأذن موقع التصوير المثالي.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم البيانات التي تم استردادها من هذه النماذج IRI محدودة لتقييم العيانية (الدرجات من القرحة) والتحليلات المجهرية من نقطة النهاية مؤشرات التهابات 10. استخدام هذا النموذج، يتم تمكين الوقت الحقيقي التصور من الاستجابة الخلوية العدلات بعد ضخه في جلد الفأر مراسل الفلورسنت. ويستخدم نموذج التصوير الأذن حيوي داخلي نشرت سابقا 8 مع تعديلات إضافية (الشكلان 1 و 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
أهمية
الأشعة تحت الحمراء هي واحدة من الأسباب الرئيسية للقرحة الضغط الجلد. في المراحل المبكرة (الأول والثاني) من قرحة الضغط تصف حالة الجلد البشري (بالمقارنة مع الأنسجة تحت الجلد الكامنة والعضلات). ومع ذلك، فهم المسببات المناعية ما ز…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Riferimenti
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel’s updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
