Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie
Summary
Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
danno da ischemia-riperfusione (IRI) si verifica quando vi è una ipossia transitoria causa l'ostruzione del flusso sanguigno (ischemia) seguita da una successiva riossigenazione dei tessuti (riperfusione). Nella pelle, ischemia-riperfusione (IR) è pensato per essere uno dei fattori che contribuiscono alla fisiopatologia delle ulcere da pressione, dove prolungato riposo a letto predispone i pazienti in ospedale a lungo termine per infortunio. In questi pazienti, sia la pelle ed i muscoli sottostanti sono costantemente esposti alla pressione del peso esercitato sulle aree di prominenza ossea, con conseguente lesioni localizzate che, se non trattata, può diventare necrotico 1.
I danni coinvolte in un IRI sono duplici. Durante l'ischemia, l'occlusione di vasi sanguigni porta ad un drastico calo di apporto di ossigeno ai tessuti. Ciò si traduce in una diminuzione di ATP e di pH, che inattiva ATPasi coinvolti nel metabolismo cellulare. A loro volta, i livelli di calcio cellulari picco, e ha sottolineato oc danneggiatiells apoptosi o necrosi 2. Il rilascio di contenuti intracellulari o danni associati modelli molecolari (grezzo), come HMGB1, contribuisce alla risposta infiammatoria 3. Il secondo insulto si verifica durante la riperfusione. Anche se i livelli di ossigeno e pH vengono ripristinati durante la riperfusione, ciò comporta la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che porta alla ossidazione dei lipidi intracellulari, DNA e proteine. Di conseguenza, i mediatori pro-infiammatori sono attivati, che scatena una risposta infiammatoria secondaria che prevede il reclutamento di cellule immunitarie al sito infiammatorio 2. Mentre la cascata di eventi biochimici che portano alla risposta infiammatoria è stata ben descritta, la regolazione spaziale e temporale delle attività delle cellule immunitarie non sono ben compresi.
Qui, descriviamo un modello IR robusta sulla pelle orecchio del mouse utilizzando semplici bloccaggio magnete. Accoppiato con l'imaging intravitale multiphoton (MP-IVM), abbiamostabilito un modello per studiare le risposte infiammatorie in vivo che si verificano dopo riperfusione avviene. La logica dietro lo sviluppo e l'utilizzo di questa tecnica è quello di cercare di capire come sia cellule interstiziali e infiltranti rispondono a infrarossi in tempo reale.
Modelli esistenti di IR utilizzando la tecnica di serraggio sul fianco pelle sono altamente invasiva, in quanto richiedono l'impianto chirurgico di piastre di acciaio a fianco pelle, rendendoli meno che ideale per studi immunologici 4. Una tecnica di fissaggio non invasiva simile è stato descritto nel 5,6 topo pelle fianco. Tuttavia, a causa della incorporazione della componente di imaging intravitale in questo metodo, abbiamo invece scelto la pelle dell'orecchio come sito IR mirato, come elude movimenti dovuti alla respirazione e offre stabilità durante l'imaging 7,8. Inoltre, sottoinsiemi leucociti che abbracciano l'interstizio sono identici tra la pelle orecchio e il fianco pelle, anche se lanumeri e proporzioni possono variare leggermente 9. Così, la pelle dell'orecchio rappresenta un sito di imaging ideale.
Inoltre, la maggior parte dei dati recuperati da questi modelli IRI sono limitati a valutazioni macroscopici (classificazione delle ulcere) e le analisi microscopiche di endpoint indicatori infiammatori 10. Utilizzando questo modello, visualizzazione in tempo reale della risposta cellulare dei neutrofili dopo riperfusione nella pelle di un topo reporter fluorescente è abilitato. Un modello di imaging intravitale orecchio precedentemente pubblicato viene utilizzato 8 con ulteriori modifiche (figure 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Importanza
IR è una delle principali cause di ulcere da pressione pelle. Le fasi (I e II) di ulcere da pressione descrivono la condizione della pelle umana (rispetto ai tessuti sottocutanei sottostanti e muscoli). Tuttavia, una comprensione della eziologia immunologica è ancora carente. Qui, vi presentiamo un modello IR semplice e robusto sulla pelle orecchio mouse per colmare questa lacuna. Simuliamo ischemia fissando l'orecchio mouse tra due magneti e successivamente studiare le rispost…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Riferimenti
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- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
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