Induserende iskemi-reperfusjon Injury i Mouse Ear Skin for intra multiphoton avbildning av immunrespons
Summary
Denne protokollen beskriver induksjon av en ischemi-reperfusjon (IR) modell på museøre huden ved hjelp av magnet fastspenning. Ved hjelp av en spesialbygd intra bildebehandling modell, studerer vi in vivo inflammatoriske responser etter reperfusjon. Begrunnelsen bak utviklingen av denne teknikken er å utvide forståelsen av hvordan leukocytter svare på huden IR skade.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
Iskemi-reperfusjonsskade (IRI) oppstår når det er en forbigående hypoksi på grunn av obstruksjon av blodstrømmen (iskemi), etterfulgt av en etterfølgende ny oksygenering av vev (reperfusjon). I huden, er iskemi-reperfusjon (IR) antas å være en av de medvirkende faktorer til patofysiologien av trykksår, hvor langvarig sengeleie predisponerer langtidssykehuspasienter til skade. Hos disse pasientene er både hud og underliggende muskler stadig utsatt for vekt press over områder av bendel, som resulterer i lokaliserte skader som, hvis venstre ubehandlet, kan bli nekrotisk en.
De som er involvert i en IRI skader er todelt. Under ischemi, okklusjon av blodkar fører til en drastisk nedgang av oksygentilførsel til vev. Dette resulterer i en reduksjon av ATP og pH, som inaktiverer ATPaser som er involvert i cellulær metabolisme. I sin tur, cellular kalsium nivåer pigg, og stresset eller skadet calen gjennomgå apoptose eller nekrose to. Utgivelsen av intracellulære innhold eller skader forbundet molekylære mønstre (damp), som HMGB1, bidrar til den inflammatoriske respons tre. Den andre fornærmelse oppstår under reperfusjon. Selv om oksygen og pH-verdier er gjenopprettet i løpet av reperfusjon, dette resulterer i dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS), som fører til oksidasjon av intracellulære lipider, DNA og proteiner. Følgelig er pro-inflammatoriske mediatorer aktivert, noe som utløser en sekundær betennelsesreaksjon som innebærer rekruttering av immunceller til provoserende for 2.. Mens kaskade av biokjemiske hendelser som fører opp til den inflammatoriske responsen har vært godt beskrevet er den romlige og tidsmessige regulering av immuncelle aktiviteter ikke godt forstått.
Her beskriver vi en robust IR-modellen på mus øret huden ved hjelp av enkel magnet klem. Sammen med multiphoton intra imaging (MP-IVM), vietablert en modell for å studere in vivo inflammatoriske responser som oppstår etter reperfusjon finner sted. Bakgrunnen for utvikling og bruk av denne teknikken er å prøve å forstå hvordan både interstitiell og infiltrere celler svare på IR i sanntid.
Eksisterende modeller av IR hjelp av klem teknikk på huden flanke er meget invasiv, da de krever kirurgisk implantering av stålplater i huden flanke, noe som gjør dem mindre enn ideelle for immunologiske studier 4. En tilsvarende ikke-invasiv klem teknikken har blitt beskrevet i musehud flanke 5,6. Men på grunn av inkorporering av den intravital avbildning komponent i denne metoden, vi i stedet valgte øret huden som det målrettede IR-området, da den omgår bevegelser på grunn av pusting og gir stabilitet under avbilding 7,8. Videre leukocytter undergrupper som strekker interstitium er identiske mellom øret hud og hud flanke, selv omantall og andelen kan variere noe 9. Dermed representerer øret huden en ideell avbildning nettstedet.
I tillegg har de fleste data som hentes fra disse IRI modellene er begrenset til makroskopiske evalueringer (gradering av magesår) og mikroskopiske analyser av endepunkt inflammatoriske indikatorer 10. Ved å bruke denne modellen, er sanntids visualisering av den cellulære responsen av neutrofiler etter reperfusjon i huden av et fluorescerende reporter mus aktivert. En tidligere utgitt intra øre bildeinformasjonen blir benyttet til 8 med ytterligere modifikasjoner (figurene 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydning
IR er en av de viktigste årsakene til hud trykksår. De tidlige stadier (I og II) av trykksår beskrive tilstanden av den menneskelige hud (i forhold til de underliggende subkutane vev og muskler). Imidlertid er en forståelse av den immunologiske etiologi fortsatt mangler. Her presenterer vi en enkel og robust IR-modellen på mus øret huden for å løse dette gapet. Vi simulerer iskemi ved å klemme på musen øret mellom to magneter og senere studere nedstrøms immunresponser ette…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Riferimenti
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel’s updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
