Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması
Summary
Bu protokol mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde bir iskemi-reperfüzyon (İR) modeli indüksiyon açıklar. Özel bir dahili Intravital görüntüleme modeli kullanarak, in vivo inflamatuvar yanıt sonrası reperfüzyon eğitim. Bu tekniğin gelişiminin arkasındaki mantık lökosit cilt IR hasarı nasıl cevap anlayışı yaygınlaştırmaktır.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
geçici hipoksi nedeniyle dokuların (reperfüzyon) bir sonraki yeniden oksijenlenme ardından kan akışının (iskemi) tıkanması olduğunda iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) oluşur. Deride, iskemi-reperfüzyon (İR) uzun süreli yatak istirahati yaralanma uzun vadeli hastane hasta yatkınlık basınç ülserlerinin patofizyolojisi, katkıda bulunan faktörlerden biri olduğu düşünülmektedir. Bu hastalarda, deri ve alttaki kaslar hem sürekli, tedavi edilmediği takdirde, nekrotik 1 olabilir lokalize yaralanmalarla sonuçlanan, kemikli öne alanları üzerine uygulanan ağırlık basınca maruz kalmaktadır.
Bir IRI katılan zarar iki yönlüdür. iskemi sırasında kan damarlarının tıkanması dokulara oksijen dağılımının ciddi bir düşüşe yol açar. Bu hücre metabolizmasında rol oynayan ATPazlar inaktive ATP ve pH, bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, hücresel kalsiyum düzeyleri başak ve stresli veya c hasarlıarşın apoptosisi ve nekrosisi 2 geçer. Hücre içi içeriğinin veya hasar ilişkili moleküler desenleri (DAMP) serbest bırakılması, HMGB1 gibi, inflamatuar yanıt 3 katkıda bulunur. İkinci hakaret reperfüzyon sırasında oluşur. oksijen ve pH düzeyleri reperfüzyon sırasında geri edilir olsa da, bu, hücre içi lipidlerin, DNA ve protein oksidasyonuna neden reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ile sonuçlanır. Sonuç olarak, pro-enflamatuar medyatörler enflamatuar bölge 2 bağışıklık hücrelerinin alınmasını içeren ikinci bir enflamatuvar yanıtı tetikler olan aktif hale gelir. enflamatuvar yanıta yol açan biyokimyasal olay zincirinin de tarif edilmiş olmakla birlikte, immün hücre faaliyetlerinin uzamsal ve geçici ayarı iyi anlaşılmış değildir.
Burada, basit mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde sağlam bir kızılötesi modeli açıklanmaktadır. multiphoton intravital görüntüleme (MP-IVM) ile birleştiğinde, bizreperfüzyon gerçekleşir sonrasında meydana in vivo enflamatuar yanıtları incelemek için bir model oluşturdu. Bu tekniğin geliştirilmesi ve kullanımı arkasındaki mantığı interstisyel ve infiltre hücreler hem gerçek zamanlı IR nasıl tepki anlamaya çalışmaktır.
Onlar immünolojik çalışmalar 4 için az daha ideal hale getirerek, cilt kanadını çelik levha cerrahi implantasyon gerektiren cilt kanadında sıkıştırma tekniğini kullanarak IR mevcut modeller, son derece invaziv. Benzer bir invasif olmayan sıkıştırma tekniği fare deri dış yan yüz 5,6 tarif edilmiştir. O nefes nedeniyle hareketlerini circumvents ve 7,8 görüntüleme sırasında istikrar sunuyor Ancak, bu yöntemde intravital görüntüleme bileşeninin birleşmesinin, bunun yerine, hedeflenen IR sitesi olarak kulak cildi seçti. Ayrıca, interstisyuma kapsayan lökosit alt-gruplar da, kulak, deri ve deri kanadı arasındaki özdeşsayılar ve oranlar biraz 9 değişebilir. Böylece, kulak cilt ideal bir görüntüleme bölgesini temsil eder.
Ayrıca, bu IRI modellerden alınan çoğu veri makroskopik değerlendirmeler (ülserlerin derecelendirme) ve son nokta inflamatuar göstergelerin 10 mikroskopik analizler sınırlıdır. Bu modeli kullanarak, bir flüoresan raportör fare deri reperfüzyon sonrası nötrofillerin hücre tepkisinin gerçek zamanlı görsel etkindir. Önceden yayınlanmış intravital kulak görüntüleme modeli ek modifikasyon (Şekil 1, 2) ile 8 kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
önem
IR cilt bası yarası önde gelen nedenlerinden biridir. (Altta yatan derialtı dokularda ve kaslara kıyasla) Basınç ülserlerinin erken aşamalarında (I ve II) insan derisinin durumunu açıklar. Ancak, immünolojik etiyolojisinde bir anlayış hala yetersizdir. Burada, bu boşluğu gidermek için fare kulak ciltte basit ve sağlam bir IR modeli sunuyoruz. Biz mıknatıs kaldırma (reperfüzyon) sonra aşağı bağışıklık tepkilerini incelemek iki mıknatıs ve daha sonra aralar?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
Riferimenti
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel’s updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
