Identifikation af fedtsyrer i<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
Bacillus-arten indeholder forgrenede og umættede fedtsyrer (FAS) med forskellige positioner af methyl gren (iso eller anteiso) og af dobbeltbindingen. Ændringer i FA sammensætning spiller en afgørende rolle i tilpasningen af bakterier til deres miljø. Disse modifikationer medfører en ændring i forholdet mellem iso versus anteiso forgrenet FA'er, og i andelen af umættede FA'er forhold til mættet FA'er, med dobbeltbindinger oprettet i specifikke positioner. Præcis identifikation af FA profil er nødvendigt at forstå de tilpasningsmekanismer af Bacillus arter.
Mange af de FA'er fra Bacillus ikke er kommercielt tilgængelige. Den her foreslåede strategi identificerer FA'er ved at kombinere oplysninger om lagring tid (beregning af den ækvivalente kædelængde (ECL)) med massen spektre af tre typer af FA deraf: methylesterolier (fames), 4,4-dimethyl oxazolin derivater (DMOX), og3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Denne metode kan identificere de FA'er uden behov for at oprense det ukendte FA'er.
Sammenligning kromatografiske profiler for FAME fremstillet fra Bacillus cereus med en kommerciel blanding af standarder giver mulighed for identifikation af ligekædede mættede FA'er, beregningen af ECL, og hypoteser om identiteten af den anden FA'er. FAME'er af forgrenede mættede FA'er, iso eller anteiso, vise en konstant negativ skift i ECL, sammenlignet med lineære mættede FA'er med det samme antal carbonatomer. kan detekteres FAME'er af umættede FA'er ved massen af deres molekylære ioner, og resultere i et positivt skift i ECL sammenlignet med de tilsvarende mættede FA'er.
Den forgrening stilling FA'er og dobbeltbindingen stilling umættet FA'er kan identificeres ved elektron ionisering massespektre picolinyl og DMOX derivater hhv. Denne tilgang identificerer alle de ukendte mættet grened FA'er, umættede ligekædede FA'er og umættede forgrenede FA'er fra B. cereus ekstrakt.
Introduction
Fatty acid methyl ester (FAME) gaskromatografi (GC) er en væsentlig metode til lipid karakterisering. Det adskiller sig hurtigt og kvantificerer de forskellige fedtsyrer (FAS) af en prøve efter en kort ekstraktion. Derivater af methylestere er meget svingende, stabil og inert mod kromatografikolonnen, derved undgå toppe med hale. Deres identifikation er temmelig ligetil, når prøven består af kendte FA'er, fordi de kromatografiske profiler enten offentliggøres eller i forhold til standarderne. Desuden er den gentagne injektioner af kalibreringsstandarder til kvantificering af forskellige FA'er ikke påkrævet på grund af deres næsten konstant respons på flammeioniseringsdetektion (FID) 1.
Udover FID, massespektrometri (MS) detektion giver et supplerende sæt oplysninger for at bekræfte FAME'er. Men når FAME'er debiteres hjælp elektron ionisering (El), de resulterende spektre ikke altid giver mulighed for the identificering af FA finstruktur. For eksempel forgrener position (dvs. en forgrenet methylgruppe) er vanskeligt at forudsige, fordi de diagnostiske ioner er vanskelige at opdage en og den karakteristiske forandringer i målion overflod er maskinafhængig, at forhindre, at massespektre biblioteker 2. En anden udfordring ligger i at identificere dobbeltbindingen holdning, fordi EI forårsager dobbeltbinding migration. Således kan FA isomerer med varierende dobbelte bond positioner ikke differentieres af deres masse spektre. Heldigvis har andre værktøjer er udviklet til FA identifikation. For eksempel kan tilstedeværelsen og positionen af forgrening eller af dobbeltbindinger i FA'er blive conjectured ved at beregne den ækvivalente kædelængde (ECL) 3.
Andre derivatiseringsmetoder metoder resulterer i forskellige massespektre, afhængig af placeringen af en dobbeltbinding eller en forgrenet methylgruppe. 4,4-dimethyl oxazolin derivater (DMOX) 4 giver mulighed for easy identifikation af positionen af monoumættet fedtsyre dobbeltbindinger. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivater tillader utvetydig identifikation af placeringen af methyl forgrenede FA'er 5. Kombinere kromatografisk retention (ECL) og massespektrum (DMOX og picolinyl) information muliggør identifikation af de fleste FA'er uden behov for at anvende komplekse fremgangsmåder til oprensning, som kræves for kernemagnetisk resonans (NMR) spektrum, den bestrides fremgangsmåde til strukturel karakterisering 1 .
Bakterier af slægten Bacillus, som omfatter nogle humane og animalske patogener, er i stand til at kolonisere meget forskellige nicher og er derfor vidt udbredt i miljøet 6. Blandt Bacillus genus, er FA sammensætning påvirket af den økologiske niche af arterne med modulationer i FA mønstre til at tilpasse sig til en lang række miljømæssige ændringer (f.eks, vækstmedium, temperatur,pH, etc.) 7-9. På grund af den relative ensartethed af FA mønster hen arter af slægten Bacillus under vækst i standardiserede betingelser, bestemmelse af FA sammensætning er et af de vigtigste kriterier anvendes ved formuleringen af Bacillus-arter. En unik egenskab af Bacillus slægten er den overflod af forgrenede FA'er indeholdende 12-17 kulstofatomer 10-12 med forholdet mellem iso og anteiso isomerer er en vigtig faktor for tilpasning til miljøforholdene. Bacillus-arter også tilpasse sig miljømæssige udsving ved at ændre den andel af umættede fedtsyrer. I nogle arter, såsom Bacillus cereus, to fedtsyredesaturaser skabe dobbeltbindinger i forskellige positioner af alkylkæden 13 med forskellige roller i tilpasning 9. Eksemplet med Bacillus slægten illustrerer vigtigheden af nøjagtig inddeling dobbeltbindingen position og FA forgrening. Indsamlelukkende, identifikation af Bacillus FA mønstre har flere nyttige programmer. Heri foreslår vi en ny GC-MS metode til Bacillus FA mønster identifikation, der overvinder de iboende begrænsninger af et klassisk GC-MS-analyse.
Denne innovative tilgang kan anvendes direkte på rå biologisk materiale, og består af en kombination af eksisterende teknikker: oplysninger om opholdstider (ECL) og masse spektre af forskellige FA'er derivater (FAME, DMOX og picolinyl-ester).
Vi bruger følgende FA nomenklatur. i, en, og n angiver iso, anteiso methyl forgrenede og ligekædede fedtsyre, hhv. Umættede FA'er blev navngivet af C: d hvor C er antallet af carbonatomer i fedtsyren og d er antallet af dobbeltbindinger. Δ x angiver positionen af dobbeltbindingen, hvor dobbeltbindingen er placeret på den X. carbon-carbon-binding, talt fra carboxylsyre ende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fas chromatogramprofiler vist i tabel 1, svarer til B. cereus ATCC 14579 dyrket på en agarplade overflade. Lignende profiler blev opnået, når bakterien blev dyrket i beluftet væske medier ved den samme temperatur 8. I tilfælde af bakterier dyrket i flydende medier, er den bakterielle biomasse opsamlet ved centrifugering af vækstmediet og kan vaskes i overensstemmelse med tidligere beskrevne protokoller afhængigt af vækstbetingelser 8,19. Identifikationen af de fors…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere er taknemmelige for Thomas Mison for hans tekniske support, og Rachel Kopec for revision af manuskriptet.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
Riferimenti
- Christie, W. W., Han, X. . Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).
- HÜbschmann, H. -. J. . Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography – Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives – A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J., Christie, W. W. . Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. . Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus – example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
