Identifisering av fettsyrer i<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
Bacillus arter inneholder forgrenede og umettede fettsyrer (fettsyrer) med forskjellige stillinger av metylforgrening (iso anteiso eller) og av dobbeltbindingen. Endringer i FA sammensetning spille en avgjørende rolle i tilpasningen av bakterier til sitt miljø. Disse modifikasjoner medfører en endring i forholdet mellom iso anteiso versus forgrenede fettsyrer, og i andelen av umettede fettsyrer i forhold til mettede fettsyrer, med dobbeltbindinger som er opprettet ved spesifikke posisjoner. Nøyaktig identifikasjon av FA-profil er nødvendig å forstå tilpasningsmekanismene Bacillus arter.
Mange av fettsyrer fra Bacillus ikke er kommersielt tilgjengelige. Strategien foreslått heri identifiserer fettsyrer ved å kombinere informasjon om oppholdstiden (ved beregning av den tilsvarende kjedelengde (ECL)) med massespektra av tre typer FA av derivater: fettsyremetylestere (fames), 4,4-dimetyl-oksazolin- derivater (DMOX), og3-pyridylcarbinyl ester (pikolinylester-). Denne fremgangsmåte kan identifisere fettsyrer uten behov for å rense det ukjente fettsyrene.
Sammenligning av kromatografiske profiler av FAME fremstilt fra Bacillus cereus med en kommersiell blanding av standarder gir mulighet for identifisering av rettkjedede mettede fettsyrer, beregning av ECL, og hypoteser om identiteten til den andre fettsyrer. Slike fettsyremetylestere av forgrenete mettete fettsyrer, iso eller anteiso, viser en konstant negativ endring i ECL sammenlignet med lineære mettede fettsyrer med det samme antall karbonatomer. Slike fettsyremetylestere av umettede fettsyrer kan påvises ved massen av deres molekylære ioner, og resultere i en positiv forskyvning i ECL sammenlignet med de tilsvarende mettede fettsyrene.
Forgrenings stilling av fettsyrer og dobbeltbindingen stilling av umettede fettsyrer kan identifiseres ved elektron ioniseringsmassespektra av pikolinylester- og DMOX-derivater, henholdsvis. Denne tilnærmingen identifiserer alt det ukjente mettet grened fettsyrer, umettede rettkjedede fettsyrer og umettede forgrenede fettsyrer fra B. cereus ekstrakt.
Introduction
Fettsyremetylester (FAME) gasskromatografi (GC) er en viktig metode for lipid karakterisering. Den skiller seg raskt og kvantifiserer de forskjellige fettsyrer (FAS) av en prøve etter en kort ekstraksjonstrinn. Derivater av metylestere er svært flyktig, stabil og inert overfor den kromatografiske kolonne, og dermed unngå tailing topper. Deres identifikasjon er ganske grei når prøven består av kjente fettsyrer fordi de kromatografiske profilene er enten publisert eller i forhold til standarder. I tillegg er en gjentatt injeksjon av kalibreringsstandarder for kvantifisering av forskjellige fettsyrer ikke nødvendig, gitt deres nesten konstant respons på flammeioniseringsdeteksjon (FID) 1.
I tillegg til FID, gir massespektrometri (MS) deteksjon et komplementært sett med informasjon for å bekrefte Slike fettsyremetylestere. Men når Slike fettsyremetylestere belastes ved hjelp av elektron-ionisering (EI), de resulterende spektra ikke alltid tillater the identifisering av FA fin struktur. For eksempel, forgrening stilling (dvs. en forgrenet metylgruppe) er vanskelig å forutsi fordi de diagnostiske ioner er vanskelige å oppdage en og den karakteristiske forandring i mål-ion overflod er maskinavhengig, hindrer bruk av massespektrene biblioteker 2. En annen utfordring ligger i å identifisere dobbeltbindingen posisjon fordi EI fører dobbeltbinding migrasjon. Således kan FA isomerer med varierende dobbeltbinding-stillingene ikke kan differensieres ved deres massespektra. Heldigvis har andre verktøy er utviklet for FA identifikasjon. For eksempel kan tilstedeværelsen og posisjonen av forgrening eller dobbeltbindinger i fettsyrer bli antatt ved beregningen av tilsvarende kjedelengde (ECL) 3.
Andre derivatiseringsreaksjoner metoder resultere i ulike massespektra, avhengig av plasseringen av en dobbeltbinding eller en forgrenet metylgruppe. 4,4-dimetyl oksazolin derivater (DMOX) 4 gir mulighet for EASy identifikasjon av posisjonen til enumettet fettsyre-dobbeltbindinger. 3-pyridylcarbinyl ester (pikolinylester- esterderivater) åpner for entydig identifikasjon av plasseringen av metyl-forgrenede fettsyrer 5. Ved å kombinere kromatografisk retensjon (ECL) og massespektra (DMOX og pikolinylester-) informasjon muliggjør identifisering av de fleste fettsyrer, uten å måtte bruke kompliserte rensemetoder, som er nødvendig for kjernemagnetisk resonans (NMR) spektrum, det uncontestable fremgangsmåte for strukturell karakterisering 1 .
Bakterier av slekten Bacillus, som inkluderer noen humane og animalske patogener, er i stand til å kolonisere svært forskjellige nisjer og er derfor vidt distribuert i miljøet 6. Blant de Bacillus-slekten, blir FA sammensetning påvirkes av den økologiske nisje av artene med modulasjonene i FA-mønstre for å tilpasse seg til et bredt spekter av miljømessige endringer (for eksempel vekstmediet, temperatur,pH, etc.) 7-9. På grunn av den relative homogenitet i FA mønster på arter av slekten Bacillus i løpet av vekst i standardiserte forhold, bestemmelse av FA preparat er en av de grunnleggende kriterier som brukes for å definere Bacillus arter. En unik egenskap av Bacillus slekten er overflod av forgrenede fettsyrer som inneholder 12-17 karbonatomer 10-12 med forholdet mellom iso og anteiso isomerer være en viktig faktor for tilpasning til miljøforhold. Bacillus arter også tilpasse seg miljø svingninger ved å forandre andelen av umettede fettsyrer. I noen arter, for eksempel Bacillus cereus, to fettsyre desaturaser lage dobbeltbindinger i forskjellige posisjoner av alkylkjeden 13 med forskjellige roller i tilpasning 9. Eksempelet med Bacillus slekten illustrerer viktigheten av nøyaktig identifisering dobbeltbindingen stilling og FA forgrening. Samle innively, identifisering av Bacillus FA mønstre har flere nyttige programmer. Heri, foreslår vi en ny GC-MS metode for Bacillus FA mønster identifikasjon som overvinner de iboende begrensningene i en klassisk GC-MS analyse.
Denne innovative tilnærmingen kan brukes direkte på rå biologisk materiale, og består av en kombinasjon av eksisterende teknikker: informasjon om oppholdstider (ECL) og massespektra av ulike FAS derivater (FAME, DMOX og pikolinylester–ester).
Vi bruker følgende FA nomenklatur. i, en, og n angir iso, anteiso metyl forgrenet og rettkjedet fettsyre, henholdsvis. Umettede fettsyrer ble navngitt ved C: D hvor C er antallet karbonatomer i fettsyren og d er antallet dobbeltbindinger. Δ x angir posisjonen av dobbeltbindingen, hvor dobbeltbindingen er plassert på x.-karbon-karbonbinding, regnet fra karboksylsyren ende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fas-kromatogram profilene som er vist i tabell 1 samsvarer med B. cereus ATCC 14579 dyrket på en agarplate overflate. Lignende profiler ble oppnådd når bakterien ble dyrket i utluftet flytende medium ved den samme temperatur 8. I tilfellet med bakterier som var dyrket i flytende medier, er den bakterielle biomasse samlet opp ved sentrifugering av vekstmediet og kan vaskes i henhold til tidligere beskrevne protokoller avhengig av vekstbetingelsene 8,19. Identifiseringen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere er takknemlige til Thomas Mison for sin tekniske støtte, og til Rachel Kopec for å revidere manuskriptet.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
Riferimenti
- Christie, W. W., Han, X. . Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).
- HÜbschmann, H. -. J. . Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography – Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives – A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J., Christie, W. W. . Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. . Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus – example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
