Denna rapport beskriver en bioteknik metod för att utforma och konstruera nya Artificiella Skarv Faktorer (ASFs) som specifikt modulerar splitsning av målgener i däggdjursceller. Denna metod kan utvidgas ytterligare för att konstruera olika artificiella faktorer att manipulera andra aspekter av RNA-metabolism.
Bearbetning av de flesta eukaryota RNA medieras av RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) med modulära konfigurationer, inkluderande en modul RNA erkännande, som specifikt binder den pre-mRNA-mål och en effektordomän. Tidigare har vi dragit fördel av den unika RNA-bindningsläge för PUF-domänen i humant pumilio 1 för att generera en programmerbar RNA-bindande scaffold, som användes för att konstruera olika artificiella RBP-anordningama för att manipulera RNA-metabolism. Här, är ett detaljerat protokoll beskrivs att konstruera Engineered Skarv Faktorer (ESFS) som är särskilt utformade för att modulera alternativ splitsning av målgener. Protokollet innefattar hur man kan utforma och konstruera en anpassad PUF byggnadsställning för ett specifikt mål-RNA, hur man konstruerar en ESF expressionsplasmid genom att fusera en designer PUF domän och en effektordomän, och hur man använder ESFS att manipulera splitsning av målgener. I representativa resultat av denna metod har vi också beskrivit de gemensamma analysernaav ESF-aktiviteter med hjälp av splits reportrar, tillämpningen av ESF i odlade humana celler, och den efterföljande effekten av splits förändringar. Genom att följa de detaljerade protokoll i denna rapport är det möjligt att utforma och skapa ESFS för reglering av olika typer av alternativ splitsning (AS), vilket ger en ny strategi för att studera skarvning reglering och funktion olika skarv isoformer. Dessutom, genom att fusera olika funktionella domäner med en designad PUF domän kan forskare ingenjör artificiella faktorer som riktar specifika RNA för att manipulera olika steg i RNA-bearbetning.
De flesta humana gener genomgår Alternativ Splicing (AS) för att producera flera isoformer med olika aktiviteter, vilket kraftigt har ökat den kodande komplexiteten hos genomet 1 , 2 . AS tillhandahåller en viktig mekanism för att reglera genfunktionen, och den regleras strikt genom olika vägar i olika cellulära och utvecklingssteg 3 , 4 . Eftersom splitsning av felreglering är en vanlig orsak till mänsklig sjukdom 5 , 6 , 7 , 8 , blir målriktning av splitsningsreglering en attraktiv terapeutisk väg.
Enligt en förenklad modell för splitsningsreglering kontrolleras AS huvudsakligen av Splicing Regulatory cis- Elements (SREs) i pre-mRNA som fungerar som splicing enhancers eller silencers of alternative exons. ThEse SREs rekryterar specifikt olika transaktiva proteinfaktorer ( dvs splitsningsfaktorer) som främjar eller undertrycker splitsningsreaktionen 3 , 9 . De flesta transaktiva splitsningsfaktorerna har separata sekvensspecifika RNA-bindande domäner för att igenkänna deras mål och effektordomäner för att styra splitsning. De mest kända exemplen är medlemmarna i den serin / argininrika (SR) -proteinfamiljen som innehåller N-terminala RNA-erkännandemotiv (RRM), vilka binder exoniska splitsningsförstärkare och C-terminala RS-domäner, vilket främjar exon inkludering 10 . Omvänt binder hnRNP A1 till exoniska splitsningsdämpare genom RRM-domänerna och hämmar exonintegration genom en C-terminal glycinrik domän 11 . Med hjälp av sådana modulära konfigurationer bör forskare kunna konstruera artificiella splitsningsfaktorer genom att kombinera en specifik RNA-bindande domän (RBD) med olika effekttor domäner som aktiverar eller hämmar splitsning.
Nyckeln till en sådan utformning är att använda en RBD som identifierar given mål med programmerbar RNA bindningsspecificitet, som är analog med den DNA-bindande läget av berättelsen domänen. Dock de flesta nativa splitsningsfaktorer innehåller RRM eller K Homologi (KH) domäner, som känner igen korta RNA element med svag affinitet och således saknar en prediktiv RNA-proteinigenkänning "kod" 12. RBD av PUF upprepningsproteiner (dvs. PUF-domänen) har en unik RNA-igenkänningsmoden, vilket möjliggör den nya utformningen av PUF domäner att specifikt känna igen olika RNA-mål 13, 14. Den kanoniska PUF domänen innehåller åtta upprepningar av tre a-helixar, vardera som igenkänner en enda bas i en 8-nt RNA-målet. Sidokedjorna av aminosyror vid vissa positioner för de andra α-helix bildar specifika vätebindningar med Watson-Crick-kanten av than RNA bas, som bestämmer det RNA-bindande specificiteten för varje upprepning (Figur 1A). Koden för RNA bas erkännande av PUF upprepningen är förvånansvärt enkel (figur 1 A), vilket möjliggör generering av PUF domäner som känner igen eventuella 8-baskombination (översikt av Wei och Wang 15).
Denna princip modulär design tillåter generering av en Engineered Skarvning Factor (ESF) som består av en anpassad PUF domän och en skarvningsmodule-domän (t.ex. en SR-domän eller en Gly-rika domän). Dessa ESFS kan fungera som antingen splits aktivatorer eller som inhibitorer för att styra olika typer av splitsningshändelser, och de har visat sig vara användbara som verktyg för att manipulera splitsning av endogena gener relaterade till human sjukdom 16, 17. Som ett exempel, har vi konstruerat PUF-Gly-typ ESFS att specifikt förändra splitsning av Bcl-genen, Omvandling av den anti-apoptotiska lång isoform (BcI-Xl) till pro-apoptotiska korta isoformen (Bcl-xS). Skiftning förhållandet mellan Bcl-x-isoform var tillräcklig för att sensibilisera flera cancerceller till flera anticancerkemoterapiläkemedel 16, vilket tyder på att dessa artificiella faktorer kan vara användbara som potentiella terapeutiska reagens.
Förutom att styra splitsning med kända skarvnings effektordomäner (t ex en RS eller Gly-rika domän), kan de konstruerade PUF faktorer också användas för att undersöka verksamheten i nya splitsfaktorer. Exempelvis med användning av detta tillvägagångssätt har vi visat att den C-terminala domänen av flera SR proteiner kan aktivera eller inhibera splitsning då bindning till olika pre-mRNA-områdena 18, att den alanin-rika motivet av RBM4 kan hämma splitsning 19, och att den prolinrika motiv i DAZAP1 kan förbättra skarvning 20, 21 </ Sup>. Dessa nya funktionella domäner kan användas för att konstruera ytterligare typer av konstgjorda faktorer för att finjustera skarvning.
Denna rapport ger en detaljerad beskrivning av konstruktionen och konstruktionen av artificiella splicingsfaktorer som specifikt kan manipulera den alternativa splitsningen av en målgen. Denna metod utnyttjar det unika RNA-bindnings-läget för PUF-repeter för att producera ett RNA-bindningsställ med anpassad specificitet. Det kan användas för att antingen aktivera eller undertrycka splitsning.
Det kritiska steget i detta protokoll är genereringen av den omprogrammerade PUF-domänen so…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-CA158283 och NSFC ger 31.400.726 till ZWYW finansieras av Young tusen talenter Program och National Natural Science Foundation of China (bidrag 31471235 och 81422038). XY finansieras av postdoktorala Science Foundation of China (2015M571612).
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
Triton-X100 | Promega | H5142 | |
Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |