Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

Huan-Huan Wei; Yuanlong Liu; Yang Wang; Qianyun Lu; Xuerong Yang; Jiefu Li; Zefeng Wang

doi:10.3791/54967

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Articolo metodologico

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l'alternanza di splicing nelle cellule umane

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DOI:

10.3791/54967

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26 aprile 2017

Huan-Huan Wei^*¹ , Yuanlong Liu^*¹ , Yang Wang² , Qianyun Lu¹ , Xuerong Yang¹ , Jiefu Li¹ , Zefeng Wang¹

¹Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), ²Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.

Abstract

Il trattamento della maggior parte RNA eucariotici è mediata da RNA Binding Proteins (RBPs) con configurazioni modulari, tra cui un modulo di riconoscimento di RNA, che si lega specificamente al bersaglio pre-mRNA e un dominio effettore. In precedenza, abbiamo preso vantaggio della modalità di legame dell'RNA unica del dominio PUF in pumilio umano 1 per generare un ponteggio programmabile vincolante RNA, che è stato utilizzato per progettare vari RBPs artificiali per manipolare il metabolismo dell'RNA. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per costruire fattori di splicing Engineered (ESFS) che sono specificamente progettati per modulare lo splicing alternativo di geni bersaglio. Il protocollo comprende come progettare e costruire un ponteggio PUF personalizzato per uno specifico bersaglio RNA, come costruire un plasmide di espressione FSE fondendo un designer dominio PUF e un dominio effettore, e come utilizzare ESFS per manipolare lo splicing di geni bersaglio. Nei risultati rappresentativi di questo metodo, abbiamo anche descritto i saggi comuniDelle attività di ESF che utilizzano reporter di splicing, l'applicazione di ESF nelle cellule umane colte e l'effetto successivo di cambiamenti di splicing. Seguendo i protocolli dettagliati in questa relazione, è possibile progettare e generare ESF per la regolazione di diversi tipi di Splicing Alternativo (AS), fornendo una nuova strategia per studiare la regolazione di splicing e la funzione di diverse isoforme di splicing. Inoltre, fondendo diversi domini funzionali con un dominio PUF progettato, i ricercatori possono progettare fattori artificiali che mirano a specificare gli RNA per manipolare varie fasi di elaborazione RNA.

Introduzione

La maggior parte dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS) per produrre molteplici isoforme con attività distinte, che ha notevolmente aumentato la complessità di codifica del genoma ^{^1,} ^2. AS fornisce un meccanismo importante per regolare la funzione del gene, ed è strettamente regolata attraverso percorsi diversi in diverse fasi cellulari e dello sviluppo ^{^3,} ^4. Perché splicing misregulation è una comune causa di malattie umane ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,}