Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em> In Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Изучение интегральных мембранных белков в пробирке часто осложняется наличием гидрофобного трансмембранного домена. Еще более усложняют эти исследования, реинкорпорация моющих-солюбилизированного мембранных белков в липосомы является случайным процессом, где топология белка невозможно провести в жизнь. Эта статья предлагает альтернативный метод для этих сложных методов, которые использует липосом на основе строительных лесов. растворимость белков усиливается за счет делеции трансмембранного домена, и эти аминокислоты заменяются привязывать остатком, такие как His-меткой. Этот фал взаимодействует с анкерной группой (Ni 2+ координируется нитрилтриуксусная кислоты (NTA (Ni 2+)) для His-меченных белков), который вводит единую топологию белка на поверхности липосом. Приведен пример, в котором взаимодействие между динамина связанных с белком 1 (drp1) с интегральным мембранным белком, митохондриальной осколочного Factor (ММФ), был Investigated с помощью этого метода эшафот липосом. В этой работе мы продемонстрировали способность ММФ эффективно вербовать растворимого drp1 к поверхности липосом, что стимулировало его активность ГТФ. Кроме того, drp1 смог придавать трубчатую форму ММФ-украшенный шаблон липидов в присутствии специфических липидов. Этот пример демонстрирует эффективность каркасных липосом с использованием структурных и функциональных анализов и выдвигает на первый план роль ММФ в регуляции активности drp1.
Introduction
Изучение мембранных проксимальных белок-белковых взаимодействий является сложной задачи из – за трудностей в обобщал родную среду интегральных мембранных белков , участвующих 1. Это связано с необходимостью моющего средства солюбилизации и непоследовательное ориентации белков в протеолипосомах. Для того , чтобы избежать этих проблем, мы использовали стратегию , в котором растворимые домены интегральных мембранных белков выражают в виде His-Tag слитых белков, и эти растворимые фрагменты прикреплены к каркасных липосом с помощью взаимодействий с NTA (Ni 2+) в полярных головных групп липидов поверхность. С помощью этих каркасах, липидные-проксимальный белковых взаимодействий могут быть исследованы в диапазоне липидного и белкового состава.
Мы эффективно применять этот метод для исследования критических белок-белковых взаимодействий, которые регулируют сборку митохондриального комплекса деления и изучения липидных взаимодействий, которые модулируют этот прocess 2. Во время митохондриального деления, законсервированный мембраны ремоделирования белок, называемый динамина-белок , связанный с 1 (drp1) 3, рекрутируется на поверхности наружной мембраны митохондрии (ОММ) в ответ на клеточные сигналы , которые регулируют энергетический гомеостаз, апоптический сигнализации, а также ряд других интегральные митохондриальные процессы. Этот большой, цитозольная GTPase рекрутируется на поверхности митохондрий через взаимодействие с интегральными белками OMM 4 – 8. Роль одного из таких белков, митохондриальная Деление фактор (ММФ), было трудно выяснить , из – за очевидного слабого взаимодействия с drp1 в пробирке. Тем не менее, генетические исследования ясно показали , что ММФ имеет важное значение для успешного митохондриальной 7,8 деления. Описанный в этой рукописи метод был в состоянии преодолеть прежние недостатки путем введения одновременных липидных взаимодействий, которые способствуют drp1-MFF взаимодействий. В целом, этот новый анализ reveaвел фундаментальные взаимодействия руководящих сборку митохондриального комплекса деления и обеспечило новый этап для текущих структурных и функциональных исследований этой важной молекулярной машины.
На сегодняшний день изучение взаимодействий между drp1 и MFF были осложнены гибкость , присущую MFF 9, разнородность drp1 полимеры 2,10, и трудность очистки и воссоздании полной длины MFF с интактным трансмембранный домен 11. Мы рассмотрели эти проблемы с помощью NTA (Ni 2+) эшафот липосом для воссоздания Его-меченый MFF не хватает его трансмембранный домен (MffΔTM-His 6). Эта стратегия была выгодна , поскольку MffΔTM был чрезвычайно растворим , когда чрезмерно выраженная в Е. палочка, и этот изолированный белок легко восстанавливали на эшафот липосом. Когда привязанными к этим шаблонам липида, МФФ предполагается идентичную, обращенной наружу ориентацию на поверхности мембраны.В дополнение к этим преимуществам, митохондриальные липиды, такие как кардиолипину, были добавлены к стабилизации МФФ складывание и ассоциации с мембраной 11. Кардиолипин также взаимодействует с вариабельным доменом drp1 2,12 , который может стабилизировать неупорядоченную область и облегчить сборку машин деления.
Этот надежный метод широко применим для будущих исследований, направленных на оценку мембранных проксимальных белковых взаимодействий. За счет использования дополнительных прикрепление / аффинных взаимодействий, изощренность этих Мембрана восстанавливающих исследований могут быть улучшены, чтобы имитировать дополнительные сложности, обнаруженные на поверхности мембран в клетках. В то же время, липидные композиции могут быть модифицированы, чтобы более точно имитировать родной среды этих макромолекулярных комплексов. Таким образом, этот метод обеспечивает средство для изучения относительного вклада белков и липидов в формировании мембранных морфологию к во время критических клеточного ргосцессы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предлагает метод исследования белок-белковых взаимодействий, связанных с интегральными мембранными белками. Используя модульную липосомальной леску, исследователи способны оценить активность одного или нескольких белков в липидном проксимальных среде. Предыдущие ис?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
