Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em> In Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Studier av integrerte membranproteiner in vitro, er ofte komplisert ved tilstedeværelsen av et hydrofobt transmembrandomene. Videre kompliserer disse studiene, er reincorporation av vaskemiddel-solubilisert membran proteiner i liposomer en stokastisk prosess hvor protein topologi er umulig å håndheve. Dette papiret gir en alternativ metode til disse utfordrende teknikker som benytter en liposom-baserte stillaset. oppløselighet proteinet økes ved delesjon av transmembrandomenet, og disse aminosyrer er erstattet med en deling del, slik som et His-tag. Dette tjore samvirker med en forankrings gruppe (Ni 2+ koordinert av nitriltrieddiksyre (NTA (Ni2 +)) for Hans-merkede proteiner), som håndhever en ensartet protein topologi ved overflaten av liposomet. Et eksempel er vist, karakterisert ved at interaksjonen mellom dynamin-relatert protein 1 (Drp1) med et integrert membranprotein, Mitokondriell spalting Factor (MFF), ble investigated bruke denne stillas liposomer metoden. I dette arbeidet har vi vist evne til MFF til effektivt å rekruttere oppløselig Drp1 til overflaten av liposomer, som stimulerte sin GTPase-aktivitet. Videre Drp1 var i stand til å tubulate den MFF-dekorerte lipid templat i nærvær av spesifikke lipider. Dette eksempel viser effektiviteten av stillas liposomer ved hjelp av strukturelle og funksjonelle analyser og belyser rolle i å regulere MFF Drp1 aktivitet.
Introduction
Studerer membran-proksimale protein-protein interaksjoner er en utfordrende oppgave på grunn av vanskeligheter med å rekapitulere den opprinnelige miljø av integrerte membranproteiner involvert en. Dette skyldes nødvendigheten av vaskemiddel oppløsning og inkonsekvent orientering av proteiner i proteoliposomes. For å unngå disse problemene, har vi anvendt en strategi hvorved oppløselige domener av integrerte membranproteiner er uttrykt som His-tag-fusjonsproteiner, og disse løselige fragmenter er forankret til stillas liposomer via interaksjoner med NTA (Ni2 +) hodegrupper ved lipid flate. Ved hjelp av disse stillasene, kan lipid-proksimale protein interaksjoner bli undersøkt over et spekter av lipid og protein komposisjoner.
Vi har effektivt brukt denne metoden for å undersøke kritiske protein-protein interaksjoner som styrer montering av mitokondrie fisjon komplekse og undersøke lipid interaksjoner som modulerer denne process to. Under mitokondrie fisjon, en konservert membran ombygging protein, kalt dynamin-relaterte protein 1 (Drp1) 3, blir rekruttert til overflaten av den ytre mitokondriemembranen (OMM) som reaksjon på cellulære signaler som regulerer energihomeostase, apoptotisk signalering, og flere andre integrerte mitokondrie prosesser. Denne store, cytosolic GTPase rekrutteres til overflaten av mitokondrier gjennom samhandling med integrerte OMM proteiner 4 – 8. Rollen av et slikt protein, Mitokondriell spalting Factor (MFF), har vært vanskelig å klargjøre på grunn av en tilsynelatende svake interaksjon med Drp1 in vitro. Likevel har genetiske studier tydelig vist at MFF er avgjørende for vellykket mitokondrie fisjon 7,8. Metoden som beskrives i dette manuskriptet var i stand til å overvinne tidligere mangler ved å innføre samtidige lipid interaksjonene som fremmer Drp1-MFF interaksjoner. Samlet denne romanen analysen revealedet fundamentalkraft guiding montering av mitokondrie fisjon komplekse og gitt en ny scene for pågående strukturelle og funksjonelle studier av denne viktige molekylære maskinen.
Til dags dato, har undersøkelse av interaksjonen mellom Drp1 og MFF blitt komplisert ved den iboende fleksibiliteten av MFF 9, heterogeniteten av Drp1 polymerer 2,10, og vanskeligheten med rensende og rekonstituering av full-lengde MFF med en intakt transmembrandomene 11. Vi adressert disse utfordringene ved hjelp av NTA (Ni 2+) stilla liposomer for å rekonstituere Hans-merket MFF mangler sitt transmembrandomene (MffΔTM-His 6). Denne strategien var en fordel fordi MffΔTM var ekstremt løselig når over-uttrykt i E. coli, og det isolerte protein ble lett rekonstituert på stillas liposomer. Når bundet til disse lipid malene, MFF antok en identisk utadvendt orientering på overflaten av membranen.I tillegg til disse fordeler, mitokondrielle lipider, slik som kardiolipin, ble tilsatt for å stabilisere MFF folding og assosiasjon med membranen 11. Cardiolipin samhandler også med variable domene Drp1 2,12 som kan stabilisere dette uordnede regionen og legge til rette for montering av fisjons maskiner.
Denne robuste metoden er allment gjeldende for fremtidige studier som søker å evaluere membran-proksimale protein interaksjoner. Gjennom bruk av ytterligere deling / affinitetsinteraksjoner kan raffinement av disse membranomdannings studiene økes for å etterligne ytterligere kompleksitet funnet på overflaten av membraner i cellene. På samme tid, kan lipid sammensetninger bli modifisert for mer nøyaktig å etterligne de native miljø i disse makromolekylære komplekser. I sammendrag, gir denne metoden et middel for å undersøke de relative bidragene fra proteiner og lipider i å forme membran morfologi til under kritisk cellulær procprosessene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en metode for å undersøke protein-protein interaksjoner som involverer integrerte membranproteiner. Ved å benytte en modulær liposom stillas, søkere er i stand til å vurdere aktiviteten av ett eller flere proteiner i en lipid-proksimal miljø. Tidligere studier har vist en lignende metode for reseptor-enzymer i plasmamembranen 24 – 26. Vi har ekspandert denne metoden for å innlemme lipider kofaktorer og utforske interaksjonene mellom proteiner som utgjør mec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
Riferimenti
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
