Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.
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Articolo metodologico
Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni 2+ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni 2+)) per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l'interazione tra proteine Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l'efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell'attività DRP1.
Introduzione
Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l'ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte 1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l'orientamento incoerente delle proteine in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni 2+) headgroups al lipide superficie. L'utilizzo di questi p....
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Protocollo
1. Ponteggio liposomi Preparazione
NOTA: Idealmente, esperimenti iniziali dovrebbe usare un'impalcatura relativamente semplice e informe (composto da DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine o PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-ammino-1-carbossipentil) acido imminodiacetico) succinil]. (nickel sale)) Edificio fuori di questi esperimenti, carica lipidi, flessibilità e curvatura può essere introdotto come singoli fattori con il potenziale per alterare le interazioni membrana-prossimale. Queste modifiche possono essere realizzati aggiungendo quantità definite di spec....
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Risultati
Mentre l'interazione tra DRP1 e QFP ha dimostrato di essere importante per fissione mitocondriale, questa interazione è stato difficile ricapitolare in vitro. Il nostro obiettivo era quello di emulare meglio l'ambiente cellulare in cui DRP1 e del QFP interagiscono. A tal fine, liposomi contenenti concentrazioni limitanti del NTA (Ni 2+) headgroups sono stati preparati mediante reidratazione un film lipidico come descritto sopra. La soluzione lipidica inizialmente cost.......
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Discussione
Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l'attività di una o più proteine in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica 24 - 26. Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare le intera.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento ricevuto dall'American Heart Association (SDG12SDG9130039).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fosfatidilcolina (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Fosfatidiletanolammina (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+)Avanti | Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipina (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Cloroformio | Acros Organics | ||
| Estrusore di liposomi | Avanti Lipidi polari | 610023 | |
| Cu/Rh Griglie di colorazione negative | Ted Pella | 79712 | |
| Tubo per microfuga | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Strisce per piastre per microtitolazione | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Colorante Coomassie blu istantaneo | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Cloruro di magnesio | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Caricamento colorante | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Carbinolo verde | Sigma | Aldrich 229105 | |
| Molibdato di ammonio Tetraidrato | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Pellicola da laboratorio | Parafilm | PM-996 | |
| Acetato di uranile | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscopio | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotore | Beckman | ||
| Refrigerato CentriVap Concentratore | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Lettore di micropiastre | Molecular Devices |
Riferimenti
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A.
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Ristampe e permessi
