Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Fluorescensmikroskopi har længe været anvendt til at undersøge virkningerne af transgener i zebrafisk CNS, navnlig deres virkninger på udviklingen 1. Høj opløsning mikroskopi har tilladt en detaljeret kortlægning af de cellulære processer involveret i hjernens udvikling, muskel generation, og mange andre udviklingsmæssige begivenheder 2. Undersøgelse af død af en individuel celle har været mere udfordrende, hovedsageligt på grund af de tekniske vanskeligheder for at fremkalde selektiv celledød under standard billeddiagnostiske procedurer. Men kombinationen af single-celle opløsning billeddannelse og meget målrettede ablationsteknikker tillader, undersøgelse af umiddelbare cellulære reaktioner på stress og skade, samt af de deraf følgende celle-celle-interaktioner. Forståelsen af disse processer er kritisk, især for neurodegenerative sygdomme, såsom motor neuron disease (MND), hvor neuron-glia-interaktioner er blevet vist at bidrage til progressionaf sygdommen 3.
MND, eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS), er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der påvirker motorneuroner i hjernestammen, motor cortex, og rygmarven. Tab af disse neuroner fører til muskeltab, og patienterne dør inden for 3 – 5 år efter diagnosen 4. Motoriske neuroner i rygmarven link i muskelfibrene og spiller en afgørende rolle ved at lette muskelkontraktion. Svigt af denne meddelelse eller død af disse neuroner gradvist svækker musklerne og påvirker patientens evne til at sluge, gå, tale, og trække vejret. Visualisere døden af en motor neuron og de kortsigtede konsekvenser i et levende dyr giver en glimrende mulighed for bedre at forstå de dynamiske processer involveret i normal celle homeostase og sygdom.
Zebrafisk er dukket op som en attraktiv model-system til at studere neurodegenerative sygdomme 1. Det herskyldes de fordele, som denne model organisme, såsom ekstern befrugtning, kort- udviklingsmæssige tid, optisk adgang til nervesystemet og let transgenese. Desuden evnen til nemt generere forbindelse transgene zebrafisk giver mulighed for flere strategier i forskellige celletyper mærkning. Genetisk ablation tilgange til at dræbe bestemte celletyper tillader temmelig bred forstyrrelse, men mangler den fine kontrol målrette individuelle celler 5. Laser-assisteret teknikker, på den anden side, tilvejebringe fine tidsmæssige og rumlige kontrol og er blevet anvendt til forskellige dyremodeller. Mens de fleste tilgange anvender specialiserede udstyr, såsom pulserende lasere 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller to-foton set-ups 13, andreforskergrupper har for nylig benyttet sig af en UV-laser i konventionelle konfokale mikroskoper 14.
Den her beskrevne teknik kombinerer høj opløsning konfokal mikroskopi med en UV-laser-medieret fremgangsmåde til at forårsage cellulær stress eller død i en dosisafhængig måde i udvalgte motorneuroner. Den er afhængig af brugen af almindeligt installeret 405-nm laser, er blevet testet med succes i cellekultur og i levende dyr, og giver mulighed for detaljeret karakterisering af cellulære interaktioner, såsom mikroglial opstod efter neuronal død.
Laserablation Approaches
Laser-assisteret ablationsteknikker tillader den præcise målretning af individuelle eller små grupper af celler. Kombinere denne teknik med høj opløsning mikroskopi og genetiske manipulationer i dyremodeller såsom zebrafisk tillader forskerne til systematisk at undersøge skæbne af en individuel celle og interaktionerne efter skade.
UV (405 nm) laserablation Protokollen beskrevet her skitserer, hvordan individuelle celler kan understreges eller dræbt selektivt (på en dosis-afhængig måde), mens tilstødende neuroner, glia, og axoner efterlades uskadte. Vi har med succes anvendt denne fremgangsmåde i celledyrkningsforsøg og beskriver her den detaljerede fremgangsmåde for zebrafisk rygmarven. Vi viser gennemførelsen af denne tilgang i zebrafisk rygmarven ved selektivt at understrege en individuel neuron i et netværk af andre celler (Figur 5, A og <strong> B), eller ved at dræbe en enkelt neuron straks og uden genanvendelse (figur 5, C og D).
Tidligere special lasersystemer, såsom pulseret nitrogen laser eller to-foton lasersystemer, skulle inducere vævsskade og motorisk nerve transections 10, 11, 12, 13. Disse lasersystemer med succes er blevet anvendt til at forårsage cellebeskadigelse, såsom trombose i arterier og vener 6, akut nyreskade 7, kardiel skade 8, og til at studere calcium bølger og mikroglial respons efter hjerneskade 9. Endvidere Soustelle og kolleger brugte en konventionel konfokal setup (351-nm og 364-nm UV-lasere) for at inducere skade på epitel- og gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Relevansen af zebrafisk modeller til at forstå ALS (og andre sygdomme hos mennesker)
Zebrafisk er en udbredt model organisme, især for udviklingsmæssige undersøgelser 28, 29, 30. Mens de har visse begrænsninger, deres potentiale til at modellere sygdom hos mennesker og give en forståelse af patogene molekylære mekanismer er enorm. Zebrafisk modeller er blevet veletableret for studiet af MND og har ført til vigtige molekylære indsigter 31, 32, 33, 34. Transgene zebrafisk linjer hurtigt kan generere (4 – 5 måneder) og tillade selektiv sporing af en specifik celletype, funktioner, der gør dem en værdifuld tilføjelse til de aktuelle dyremodeller af ALS. Zebrafisk embryoner / larver er optisk transparente og tilbyde unikke erfamentale fordele, som tillader langvarig, levende billeddannelse ved encellede niveau i hjernen eller rygmarven, hvilket ikke umiddelbart kan opnås i gnavermodeller (eller i mennesker). Når det kombineres med molekylære teknikker, såsom encellede ablation, dette giver en unik eksperimentel platform til undersøgelse præcise molekylære mekanismer in vivo.
Motoriske neuroner kan selektivt målrettet Brug UV Laser Ablation
Spinal neuroner i zebrafisk begynder at udvikle sig inden 10 timer efter fødslen og er etableret efter ca. 48 h 35, 36. Denne hurtige udvikling muliggør visualisering af disse neuroner i korte tidsrammer og med høj kapacitet. Motoriske neuroner som det væsentlige bindeled mellem hjerne og muskler, og i ALS, påvirkes i den motoriske hjernebark (øverste motoriske neuroner), hjernestammen og rygmarven (lavere motoriske neuroner). Tab af disse neuroner fører uundgåeligt til muscle atrofi og svaghed. Motoriske neuroner i rygmarven af zebrafisk kan identificeres ved deres forskellige fremskrivninger og ved brugen af motor-neuron promotorer som -3MNX1. Målretning cellen soma af sådanne fremspringende neuroner afslørede anterograd degeneration langs axonal projektion over tid (figur 4 og Video 1). Encellede opløsning billeddannelse af spinale motoriske neuroner desuden bekræftet phosphatidylserin translokation og deraf følgende Annexin V-mærkning efter laser ablation (se figur 4 og supplerende Video 3 i Referenceeksempel 27). Selvom vi rapporterer aktiveringen af Annexin V i døende neuroner efter vores UV laser ablation tilgang, kan vi ikke være sikre på, at den kaskade af død, der udløses under denne fremskyndede proces svarer nøjagtigt til neuronal død, der opstår i løbet af neurodegeneration eller normal celle homeostase.
Mens denne ablation tilgang er meget reproducerbarog specifikke, forskellige indlejring strategier kan også påvirke effektiviteten af UV ablation. Det er vores erfaring, var det mest succesfulde at minimere laget af agarose vi indlejret vores fisk i. Tykkere lag af omsluttende medium med et ekstra lag af æg vand kan reducere UV strøm endeligt modtages af cellen pga dæmpning og spredningseffekter, der forekommer langs strålevejen.
I fremtiden vil passage af forskellige transgene fisk linjer muliggøre visualisering af den umiddelbare og kortvarig (op til 12 timer) responser af andre påvirkede celler, såsom glia, til laser-induceret celleødelæggelse. For eksempel har astrocyt og ikke-celleautonom toksicitet i neurodegenerative lidelser, såsom ALS været i forskning spotlight og er stærkt impliceret i patogeniciteten af sporadisk og familiær ALS 37, 38. Men mekanismerne bag glial toksicitet og selektivitetmod motor neuroner er fortsat uklare. Vi og andre tog for nylig fordel af denne tilgang til at studere engulfment af døende neuroner ved mikroglia og visualiseres clearance af neuronale rester 27, 39, 40.
Kombinere ablation teknik med høj opløsning mikroskopi og markører for neuroinflammation kan forskere i fremtiden at udvide forståelsen af enkelt-celle funktion og indbyrdes forbundne cellesystemer. Karakterisering af disse processer i en in vivo indstilling er kritisk ikke blot i udviklingsmæssige indstillinger, men også i modeller for neurodegenerative sygdomme, herunder MND, hvor cellulære interaktioner kan forringes 3, 41.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
Microscope | Leica | SP5 | |
35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |