استخدام<em> فيفو السابقين</em> التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر
Summary
فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة لتحديد التركيزات النسبية للمركبات fluorescently المسمى داخل وبين الأنسجة أو مجموعات العلاج. على العكس من ذلك، كمية الأنسجة مضان، في حين أن أكثر كثيفة العمالة، يسمح لتقدير مستويات الأنسجة المطلقة من الجزيئات المسمى.
Abstract
وضع العلامات الفلورية هو عملية راسخة لدراسة مصير الجزيئات المسمى في إطار مجموعة من الظروف التجريبية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. تحقيقات الفلورسنت مفيدة بشكل خاص في تحديد التوزيع الحيوي من الجزيئات الكبيرة التي يديرها، حيث إضافة تسمية فلوري جزيء صغير من غير المحتمل أن تؤثر على حركية أو توزيع الحيوي للمجمع. مجموعة متنوعة من أساليب وجود لدراسة توزيع الحيوية التي تختلف بشكل كبير في مقدار الجهد المطلوب وعما إذا كانت القياسات الناتجة بشكل كامل الكمية، ولكن باستخدام أساليب متعددة بالتزامن يمكن توفير نظام سريع وفعال لتحليل-توزيعات الحيوي.
فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو الطريقة التي يمكن استخدامها لمقارنة بسرعة تركيزات النسبية للجزيئات الفلورسنت داخل أنسجة وبين أنواع متعددة من الأنسجة أو مجموعات العلاج. باستخدام بلات التصويرالنموذج المعد لالحيوانات الحية أو التصوير كامل الجهاز، مضان داخل أنسجة سليمة يمكن تحديد دون مزيد من المعالجة، وتوفير الوقت والعمل في الوقت الذي توفر صورة دقيقة عن مجمل توزيع الحيوي. هذه العملية هي مثالية في التجارب محاولة تحديد خصوصية نسيج مركب أو المقارنة بين مركبات مختلفة متعددة. الأنسجة الأنسجة الكمية من ناحية أخرى تتطلب مزيد من المعالجة واسعة من الأنسجة من أجل إنشاء مقياس كمي للمركبات المسمى. إجراء تقييم دقيق الحيوي التوزيع، جميع أنسجة الفائدة يجب أن تكون شرائح، مسح، وتحليل نسبة إلى منحنيات القياسية من أجل إجراء مقارنات بين الأنسجة أو مجموعات. الأنسجة الأنسجة الكمية هي المعيار الذهبي لتحديد تركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة.
هنا، نحن تصف كيف كلتا الطريقتين يمكن استخدامها معا بشكل فعال لتقييم قدرة أساليب إدارة مختلفةالثانية التعديلات مجمع لاستهداف وتقديم جزيئات fluorescently المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي 1.
Introduction
وضع العلامات الفلورية هو طريقة استخدامها وفعالة بسهولة لتحديد التوزيع الحيوي للمركبات، وذلك باستخدام مجموعة من المعدات التي هي مشتركة بين العديد من المختبرات. وFluorophores على نطاق واسع، وغير مكلفة نسبيا، ويأتي في مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية، بحيث متعددة وصفت الجزيئات يمكن استخدامها في وقت واحد دون أي تدخل. معظم fluorophores لديها مجموعة من كيمياء لتصريف الافعال لمختلف المجموعات رد الفعل على المركبات المستهدفة، وعملية اقتران واضح ومباشر عموما لمعظم أنواع المواقع التفاعلية. بالإضافة إلى ذلك، المعدات اللازمة لقياس المركبات fluorescently المسمى شائعة في العديد من المعامل. المجهر الفلورسنت، والتصوير، والماسحات الضوئية الشرائح يمكن لجميع استخدامها في ظروف مختلفة، مما يجعل استخدام العلامات الفلورية الوصول للغاية. وكثيرا ما تستخدم تسميات الفلورسنت لتحديد توزيع الحيوية وحركية من المركبات على حد سواء في الجسم الحي وخارج فيفس مع أجهزة التصوير الحية، مثل الطيف IVIS تصوير، والأنسجة الأنسجة الكمية 2،3.
وقد زاد استخدام خارج الجسم الحي التصوير كامل الجهاز باستخدام أجهزة الحية التصوير مع مرور الوقت نظرا لسهولة استخدامها والقدرة على خلق بسرعة إجراء مقارنة دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات وصفت دون الحاجة إلى مزيد من المعالجة tissues4. ومع ذلك، في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز يمكن أن تسمح لتحليل سهلة والمقارنة، فإنه لا تولد مقياس كمي للتركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. ويرجع ذلك إلى آثار تشتت الخفيفة داخل أجهزة سليمة هذا. منذ تشتت الضوء (وإلى حد أقل، الامتصاصية) يختلف حسب حجم الأنسجة وكثافة، ويمكن تصوير كامل الجهاز يقلل مستويات الأنسجة في أجهزة كبيرة أو الكثيفة. وضع معايير مناسبة لقياس تركيز المطلقة هي أيضا صعبة لأن واحدا يجب أن تحاكي سمكوكثافة كل جهاز على حدة. من ناحية أخرى، والتصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة للحصول على مستويات الأنسجة النسبية للعامل، وأنها مثالية للمقارنة بين النسبي الحيوي توزيع ذات الصلة متعددة الجزيئات (كما هو الحال في الدراسات التي تستهدف المخدرات). استراتيجية بديلة هو استخدام الأنسجة مضان الكمية، وهي تقنية مشتقة من طريقة تصوير الإشعاع الذاتي الكمي، للحصول على مستويات الأنسجة المطلقة من وكيل اختبار 5،6. بدلا من وضع كامل الحيوان أو جهاز إلى جهاز تخيل، تتطلب الأنسجة الأنسجة الكمية التي يتم شرائح كل الأنسجة، التي شنت على الشرائح، وفحصها، وتحليلها بشكل فردي. يتم إعداد معايير وكيل اختبار وشرائح في سمك نفس العينات الجهاز. من خلال قطع جميع الأجهزة ومعايير لنفس السمك، والقضاء على التباين يرجع ذلك إلى تشتت الضوء أو الامتصاصية، وكثافة مضان الأنسجة يمكن أن يكون لائقا لمنحنى القياسية لتحديد تناسق المطلقحصة. في حين أن هذا الأسلوب عندما يوظف بشكل صحيح، هو الكمي، كما أنها كثيفة العمالة وأسيء التعامل معها بسهولة. ونظرا لطبيعة أكثر تعقيدا من الأنسجة الكمية والتكلفة أعلى بكثير من العمل بالمقارنة مع التصوير كامل الجهاز، فإنه يصبح من المفيد دراسة حيث كل عملية هي الأكثر عملية لاستخدامها عند النظر في توزيع الحيوي لمركبات fluorescently المسمى. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية هذه الأساليب يمكن أن تستخدم جنبا إلى جنب لمقارنة كفاءة توزيع الحيوي من المسمى رودامين الإيلاستين مثل ببتيد (ELP)، مع أو بدون إضافة SynB1 أو تات الببتيدات اختراق الخلية، عن طريق الأنف (IN) وعن طريق الوريد (IV) طرق الإدارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز غير واضحة عموما، والتمسك بعض المفاهيم والتقنيات الأساسية يمكن أن يحسن من دقة القياسات توزيع الحيوي. موجات قصيرة من الخبرة الخفيفة على درجة عالية من التشتت والامتصاص في معظم الأنسجة، والتي كثيرا يؤثر على فائدة fluorophores الط…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
Riferimenti
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
