L'utilisation de<em> Ex Vivo</em> Imagerie entier orgue et histologie tissulaire quantitative du Bio-distribution des molécules marquées par fluorescence
Summary
Imagerie ex vivo ensemble d'organes est un procédé rapide pour la détermination des concentrations relatives des composés marqués par fluorescence à l' intérieur et entre les tissus ou les groupes de traitement. A l'inverse, la fluorescence quantitative histologie, alors que plus de main-d'oeuvre, permet la quantification des taux tissulaires absolues des molécules marquées.
Abstract
Le marquage fluorescent est un processus bien établi pour examiner le sort des molécules marquées sous une variété de conditions expérimentales à la fois in vitro et in vivo. Les sondes fluorescentes sont particulièrement utiles pour déterminer la biodistribution de grosses molécules administrées, où l'addition d'un marqueur fluorescent à petite molécule est peu susceptible d'affecter la cinétique ou la bio-distribution du composé. Une variété de méthodes existent pour étudier la biodistribution qui varient de manière significative la quantité d'effort nécessaire et si les mesures résultantes sont totalement quantitatif, mais en utilisant plusieurs méthodes en combinaison peut fournir un système efficace et rapide pour l'analyse de bio-distribution.
Imagerie ex vivo ensemble d'organes est un procédé qui peut être utilisé pour comparer rapidement les concentrations relatives des molécules fluorescentes dans les tissus et entre les divers types de tissus ou de groupes de traitement. L'utilisation d'un plat d'imagerieforme conçue pour animaux vivants ou d'imagerie ensemble d'organes, la fluorescence dans les tissus intacts peut être déterminée sans traitement ultérieur, un gain de temps et de travail tout en offrant une image précise de la bio-distribution globale. Ce procédé est idéal dans des expériences tentant de déterminer la spécificité tissulaire d'un composé ou pour la comparaison de plusieurs composés différents. histologie des tissus Quantitative d'autre part nécessite une transformation ultérieure de tissus afin de créer une mesure quantitative des composés marqués. Pour évaluer avec précision la bio-distribution, tous les tissus d'intérêt doivent être tranchés, numérisés et analysés par rapport à des courbes standard afin de faire des comparaisons entre les tissus ou les groupes. histologie tissulaire quantitative est l'étalon-or pour déterminer les concentrations de composés absolues dans les tissus.
Ici, nous décrivons comment les deux méthodes peuvent être utilisées efficacement ensemble pour évaluer la capacité des différentes méthodes d'administration, unnd modifications composés pour cibler et fournir des molécules marquées par fluorescence au système nerveux central 1.
Introduction
Le marquage fluorescent est une méthode facilement utilisable et efficace pour déterminer la bio-distribution de composés, en utilisant une gamme d'équipements qui est commun à de nombreux laboratoires. Les fluorophores sont largement disponibles, relativement peu coûteux et viennent dans une variété de longueurs d'onde, de sorte que plusieurs molécules marquées peuvent être utilisées simultanément sans interférence. La plupart des fluorophores ont une gamme de chimies de conjugaison à différents groupes réactifs présents sur les composés cibles, et le processus de conjugaison est généralement simple pour la plupart des types de sites réactifs. En outre, l'équipement nécessaire pour les mesures de composés marqués par fluorescence sont communs dans de nombreux laboratoires. microscopes fluorescents, imageurs, et les scanners de diapositives peuvent tous être utilisés dans des circonstances différentes, ce qui rend l'utilisation d'un marquage fluorescent très accessible. Des marqueurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour déterminer la biodistribution et la cinétique de composés à la fois in vivo et ex vivo avec des dispositifs d'imagerie en temps réel, tels que le spectre IVIS Imager, ainsi que par histologie tissulaire quantitative 2,3.
L'utilisation de l' imagerie ex vivo ensemble d'organes en utilisant des dispositifs d'imagerie en direct a augmenté au fil du temps en raison de leur facilité d'utilisation et la capacité de créer rapidement une comparaison précise des concentrations relatives des composés marqués sans nécessiter le traitement ultérieur de tissues4. Cependant, alors que l' ensemble d' imagerie ex vivo d' un organe peut permettre une analyse et une comparaison simple, il ne génère pas une mesure quantitative de la concentration de composés absolues à l' intérieur d' un tissu. Ceci est dû à des effets de diffusion de la lumière à l'intérieur d'organes intacts. Etant donné que la diffusion de lumière (et, dans une moindre mesure, l'absorbance) varie selon la taille et la densité des tissus, l'imagerie entière organe peut sous-estimer les niveaux de tissu dans les organes de grande taille ou denses. Formuler des normes appropriées pour les mesures de concentration absolue est également difficile parce qu'il faut imiter l'épaisseuret la densité de chaque organe individuel. D'autre part, l'imagerie ensemble d'organes est une méthode rapide pour obtenir les taux tissulaires relatifs d'un agent, et il est idéal pour comparer la bio-distribution relative des multiples molécules associées (par exemple, dans des études de ciblage de médicament). Une stratégie alternative consiste à utiliser quantitative histologie de fluorescence, une technique dérivée de la méthode de autoradiographie quantitative, pour obtenir des concentrations tissulaires absolues d'un agent d'essai 5,6. Plutôt que de placer un animal ou d'un organe entier dans un dispositif d'imagination, histologie quantitative des tissus exige que chaque tissu est découpé en tranches, montées sur des lames, numérisées et analysées individuellement. Les normes de l'agent d'essai sont préparés et découpés à la même épaisseur que les échantillons d'organes. En coupant tous les organes et les normes de la même épaisseur, la variabilité due à la diffusion de lumière ou l'absorbance est éliminée, et l'intensité de fluorescence de tissus peut être adaptée à la courbe standard pour déterminer concent absolueration. Bien que cette méthode, lorsqu'elle est effectuée correctement, est quantitative, il est également de main-d'œuvre et facilement mal géré. Étant donné la nature plus complexe de l'histologie quantitative et le coût nettement plus élevé de la main-d'œuvre par rapport à l'imagerie ensemble d'organes, il devient intéressant d'examiner où chaque processus est plus pratique à utiliser lors de l'examen de la bio-distribution des composés marqués par fluorescence. Ce protocole fournit une description détaillée de la façon dont ces méthodes peuvent être utilisées ensemble pour comparer efficacement la bio-distribution du polypeptide élastine comme marqué à la rhodamine (PEL), avec ou sans l'addition des peptides de pénétration cellulaire SynB1 ou Tat, par l'intermédiaire du intranasale (IN) et intraveineuse (IV) voies d'administration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que l' imagerie ex vivo entier organe est généralement simple, l'adhésion à certains concepts et techniques de base peut améliorer la précision des mesures de bio-distribution. Courtes longueurs d'onde de la lumière l'expérience d'un degré élevé de dispersion et d'absorption dans la plupart des tissus, ce qui un impact significatif sur l'utilité des fluorophores courte longueur d'onde. Ces fluorophores ont application dans des études en profondeur des tissus li…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
Riferimenti
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
