Die Verwendung von<em> Ex Vivo</em> Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen
Summary
Ex – vivo – Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen.
Abstract
Fluoreszenzmarkierung ist ein gut etabliertes Verfahren , das Schicksal der markierten Moleküle unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Prüfung sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzsonden sind besonders nützlich bei der biologischen Verteilung von großen Molekülen verabreicht Bestimmung, wobei die Zugabe eines niedermolekularen fluoreszierenden Markierung unwahrscheinlich ist, die Kinetik oder bio-Verteilung der Verbindung beeinflussen. Eine Vielzahl von Methoden existieren Biodistribution zu untersuchen, die deutlich in der Aufwand variieren erforderlich ist und ob die sich ergebenden Messungen sind vollständig quantitative, sondern mehrere Methoden in Verbindung verwenden, können bio-Verteilungen ein schnelles und wirksames System für die Analyse bereitzustellen.
Ex – vivo – Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein Verfahren , das schnell verwendet werden kann , um die relativen Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen innerhalb von Geweben vergleichen und zwischen mehreren Arten von Geweben oder Behandlungsgruppen. Mit Hilfe eines Imaging-platForm für lebende Tiere oder ganze Organ Bildgebung, Fluoreszenz in intakten Geweben kann ohne weitere Verarbeitung bestimmt werden, Zeit und Arbeitsersparnis und bietet gleichzeitig ein genaues Bild von der gesamten Bio-Verteilung ausgelegt. Dieses Verfahren ist ideal in Experimenten versucht, die Gewebespezifität einer Verbindung zu bestimmen, oder für den Vergleich von mehreren verschiedenen Verbindungen. Quantitative Gewebe Histologie auf der anderen Seite erfordert umfangreiche Weiterverarbeitung der Gewebe, um ein quantitatives Maß für die markierten Verbindungen zu schaffen. Zur genauen biologischen Verteilung beurteilen, alle Gewebe von Interesse muss in Scheiben geschnitten, gescannt werden, und in Bezug auf Standardkurven analysiert, um Vergleiche zwischen den Geweben oder Gruppen zu machen. Quantitative Gewebe Histologie ist der Goldstandard für absolute Verbindungskonzentrationen im Gewebe zu bestimmen.
Hier beschreiben wir, wie beide Methoden verwendet werden können, zusammen effektiv die Fähigkeit verschiedener Verabreichungsmethoden zur Beurteilung einesnd Verbindung Modifikationen zielen und fluoreszierend markierte Moleküle an das zentrale Nervensystem 1 zu liefern.
Introduction
Fluoreszenzmarkierung ist ein leicht eingesetzt und effektives Verfahren zur biologischen Verteilung von Verbindungen zu bestimmen, die eine Reihe von Geräten verwendet, die auf vielen Laboratorien üblich ist. Fluorophore sind überall erhältlich, relativ kostengünstig und kommen eine Vielzahl von Wellenlängen in, so dass mehrere markierte Moleküle ohne Störung gleichzeitig verwendet werden können. Die meisten Fluorophore haben eine Reihe von Chemien für die Konjugation an verschiedene reaktive Gruppen an Zielverbindungen und das Verfahren der Konjugation ist für die meisten Arten von reaktiven Stellen im allgemeinen einfach. Darüber hinaus sind die Geräte für die Messungen von fluoreszenzmarkierten Verbindungen erforderlich, die in vielen Labors. Fluoreszierende Mikroskope, Imager und Diascanner können alle unter verschiedenen Umständen verwendet werden, die sehr zugänglich Verwendung von fluoreszierenden Markierung zu machen. Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden , häufig die Biodistribution und die Kinetik der Verbindungen zu bestimmen , sowohl in vivo als auch ex vivo mit Live – Imaging – Geräte, wie zum Beispiel die IVIS Spectrum Imager und durch quantitative Gewebe Histologie 2,3.
Die Verwendung von ex vivo Voll organ Abbildungs Live-Bilderzeugungsvorrichtungen verwendet , hat im Laufe der Zeit erhöhte sich aufgrund ihrer einfachen Verwendung und Fähigkeit, schnell einen genauen Vergleich der relativen Konzentrationen von markierten Verbindungen zu erstellen , ohne die Weiterverarbeitung von tissues4 erfordern. Während jedoch ex vivo Vollorgan Bildgebung für die einfache Analyse und den Vergleich ermöglichen kann, ist es nicht eine quantitative Messung der absoluten Konzentrationen der Verbindung innerhalb eines Gewebes zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte innerhalb intakter Organe. Da die Lichtstreuung (und in einem geringeren Ausmaß, Extinktion) variiert je nach Gewebegröße und Dichte können ganze Organbildgebungsgewebespiegel in großen oder dichten Organen unterschätzen. geeignete Standards für absolute Konzentrationsmessungen Formulieren ist auch schwierig, weil man die Dicke nachahmen mussund die Dichte jedes einzelnen Organs. Auf der anderen Seite, ist ganze Organ Bildgebung ein schnelles Verfahren, die relativen Gewebespiegel eines Mittels zu erhalten, und es ist ideal für die relative biologische Verteilung mehrerer verwandter Moleküle (wie in Drug-Targeting-Studien) verglichen wird. Eine alternative Strategie ist es, quantitative Fluoreszenz Histologie zu verwenden, eine Technik , die aus dem Verfahren der quantitative Autoradiographie abgeleitet, absolute Gewebespiegel eines Testmittels 5,6 zu erhalten. Anstatt Platzierung ein ganzes Tier oder ein Organ in ein Vorstellen Gerät erfordert quantitative Gewebe Histologie, dass jedes Gewebe geschnitten werden, auf Schlitten montiert, gescannt und einzeln analysiert. Standards des Testmittels werden mit der gleichen Dicke wie die Organproben vorbereitet und in Scheiben geschnitten. Durch das Schneiden wird alle Organe und Standards auf die gleiche Dicke, die Variabilität aufgrund von Lichtstreuung oder Absorption eliminiert und Gewebefluoreszenzintensität kann mit der Standardkurve fit absolute concent zu bestimmen,Ration. Während dieses Verfahren, wenn es richtig gemacht, quantitativ ist, es ist auch arbeitsintensiv und leicht falsch behandelt. die komplexer Natur der quantitativen Histologie und der deutlich höhere Arbeitskosten im Vergleich zu den gesamten Organ Bildgebung Da wird es lohnt sich zu untersuchen, wo jeder Prozess am praktischsten ist zu verwenden, wenn die Bio-Verteilung der fluoreszenzmarkierte Verbindungen zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine ausführliche Beschreibung, wie diese Verfahren zusammen verwendet werden, um effizient die biologische Verteilung von Rhodamin-markiertem Elastin-ähnliches Polypeptid (ELP), mit oder ohne den Zusatz der SynB1 oder Tat zellpenetrierenden Peptide zu vergleichen, über die intranasal (IN) und intravenösen (IV) Verabreichungswege.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während ex vivo Vollorgan Bildgebung im Allgemeinen einfach ist, kann die Einhaltung einiger grundlegender Konzepte und Techniken , um die Genauigkeit der Bio-Verteilungsmessungen verbessern. Kurze Wellenlängen des Lichts Erfahrung ein hohes Maß an Streuung und Absorption in den meisten Geweben, die wesentliche Auswirkungen auf die Nützlichkeit der kurzwelligen Fluorophore. Diese Fluorophore haben eine begrenzte Anwendung in Tiefgewebeuntersuchungen, aber sie haben effektiv in Experimenten verwendet wurden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
Riferimenti
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
