का उपयोग<em> पूर्व विवो</em> पूरे अंग इमेजिंग और मात्रात्मक ऊतक प्रोटोकॉल fluorescently लेबल अणु की जैव वितरण निर्धारित करने के लिए
Summary
पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग के भीतर और ऊतकों या उपचार समूहों के बीच fluorescently लेबल यौगिकों के रिश्तेदार सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक तेजी से विधि है। इसके विपरीत, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति ऊतक विज्ञान, जबकि अधिक श्रम गहन, लेबल अणुओं का पूर्ण ऊतक स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है।
Abstract
फ्लोरोसेंट लेबलिंग दोनों इन विट्रो में और vivo में प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म के तहत लेबल अणुओं के भाग्य की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रिया है। फ्लोरोसेंट जांच प्रशासित बड़े अणुओं की जैव वितरण, जहां एक छोटे अणु फ्लोरोसेंट लेबल के अलावा कैनेटीक्स या यौगिक की जैव वितरण को प्रभावित करने की संभावना नहीं है निर्धारित करने में विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। तरीकों की एक किस्म जैव वितरण उस प्रयास की राशि की आवश्यकता में काफी भिन्नता है और जांच करने के लिए मौजूद है, जिसके परिणामस्वरूप माप पूरी तरह से मात्रात्मक हैं, लेकिन संयोजन के रूप में कई तरीकों का उपयोग जैव वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और प्रभावी प्रणाली प्रदान कर सकते हैं।
पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग एक तरीका है कि जल्दी से ऊतकों के भीतर और ऊतकों या उपचार समूहों के कई प्रकार के बीच फ्लोरोसेंट अणु के रिश्तेदार सांद्रता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक इमेजिंग बेनी का प्रयोगबरकरार ऊतकों के भीतर लिव-जानवर या पूरे अंग इमेजिंग, प्रतिदीप्ति के लिए डिज़ाइन किया गया प्रपत्र आगे की प्रक्रिया के बिना निर्धारित किया जा सकता है, समय और श्रम की बचत समग्र जैव वितरण की सही तस्वीर प्रदान करते हुए। यह प्रक्रिया एक परिसर के ऊतक विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए प्रयास प्रयोगों में या कई विभिन्न यौगिकों की तुलना के लिए आदर्श है। दूसरी तरफ मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान आदेश लेबल यौगिकों का एक मात्रात्मक उपाय बनाने के लिए ऊतकों की व्यापक आगे की प्रक्रिया की आवश्यकता है। सही जैव वितरण का आकलन करने के लिए, ब्याज के सभी ऊतकों, कटा हुआ होना चाहिए स्कैन, और आदेश ऊतकों या समूहों के बीच तुलना करने में मानक घटता के सापेक्ष विश्लेषण किया। मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान ऊतकों के भीतर पूर्ण यौगिक सांद्रता निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक है।
यहाँ, हम वर्णन कैसे दोनों तरीकों साथ प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न तरीकों प्रशासन एक की क्षमता का आकलन करने के लिएएन डी यौगिक संशोधनों को निशाना बनाने और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए 1 fluorescently लेबल अणुओं देने के लिए।
Introduction
फ्लोरोसेंट लेबलिंग, यौगिकों की जैव-वितरण का निर्धारण उपकरणों की एक श्रृंखला में कई प्रयोगशालाओं के लिए आम है कि प्रयोग करने के लिए एक आसानी से उपयोग किया और प्रभावी तरीका है। Fluorophores व्यापक रूप से उपलब्ध अपेक्षाकृत सस्ती हैं, और तरंग दैर्ध्य, कि इस तरह के कई लेबल अणुओं के हस्तक्षेप के बिना एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म में आते हैं। अधिकांश fluorophores लक्ष्य यौगिकों पर विभिन्न समूहों के लिए प्रतिक्रियाशील विकार के लिए chemistries की एक श्रृंखला है, और विकार की प्रक्रिया आम तौर पर प्रतिक्रियाशील साइटों के सबसे प्रकार के लिए सीधा है। इसके अतिरिक्त, उपकरण fluorescently लेबल यौगिकों के मापन के लिए आवश्यक कई प्रयोगशालाओं में आम हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, लगे, और स्लाइड स्कैनर सब अलग अलग परिस्थितियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के उपयोग अत्यधिक सुलभ बना रही है। फ्लोरोसेंट लेबल अक्सर जैव वितरण और दोनों विवो और पूर्व viv में यौगिकों के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंलाइव इमेजिंग उपकरणों, ऐसे IVIS स्पेक्ट्रम इमेजर, के रूप में और मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान 2,3 के साथ ओ।
रहते इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग के उपयोग के उपयोग और जल्दी tissues4 की आगे की प्रक्रिया की आवश्यकता के बिना लेबल यौगिकों के रिश्तेदार सांद्रता का एक सटीक तुलना की क्षमता पैदा करने के अपने आसानी के कारण समय अधिक बढ़ गया है। हालांकि, जबकि पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग आसान विश्लेषण और तुलना के लिए अनुमति दे सकते हैं, यह एक ऊतक के भीतर पूर्ण यौगिक सांद्रता के एक मात्रात्मक उपाय उत्पन्न नहीं करता है। यह बरकरार अंगों के भीतर रोशनी बिखरने प्रभाव के कारण है। प्रकाश बिखरने (और, एक हद तक कम करने, absorbance के लिए) ऊतक आकार और घनत्व से भिन्न होता है के बाद से, पूरे अंग इमेजिंग बड़े या घने अंगों में ऊतक के स्तर के मूल्यवान समझना सकते हैं। पूर्ण एकाग्रता मापन के लिए उपयुक्त मानकों को तैयार करने में भी मुश्किल है, क्योंकि एक मोटाई की नकल करना चाहिएऔर प्रत्येक व्यक्ति के अंग के घनत्व। दूसरी ओर, पूरे अंग इमेजिंग एक एजेंट के रिश्तेदार ऊतक का स्तर प्राप्त करने का एक तेजी से विधि है, और यह (जैसे दवा को निशाना बनाने के अध्ययन के रूप में) कई संबंधित अणुओं के रिश्तेदार जैव वितरण की तुलना के लिए आदर्श है। एक वैकल्पिक रणनीति, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति ऊतक विज्ञान, तकनीक एक मात्रात्मक autoradiography की विधि से निकाली गई उपयोग एक परीक्षण एजेंट 5,6 के पूर्ण ऊतक स्तर को प्राप्त करने के लिए है। एक कल्पना डिवाइस में एक पूरी जानवर या अंग रखने के बजाय, मात्रात्मक ऊतक ऊतक विज्ञान की आवश्यकता है कि प्रत्येक ऊतक कटा हुआ हो, स्लाइड, स्कैन पर मुहिम शुरू की है, और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया। परीक्षण एजेंट के मानक तैयार किया है और अंग नमूने के रूप में एक ही मोटाई में कटा हुआ है। एक ही मोटाई के सभी अंगों और मानकों के काटने से, प्रकाश बिखरने या absorbance के कारण परिवर्तनशीलता समाप्त हो रहा है, और ऊतक प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक वक्र के लिए फिट हो पूर्ण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए कर सकते हैंराशन। हालांकि इस पद्धति, जब ठीक से किया है, मात्रात्मक है, यह भी श्रम प्रधान और आसानी से mishandled है। मात्रात्मक ऊतक विज्ञान और श्रम की लागत काफी अधिक से अधिक जटिल प्रकृति को देखते हुए, जब पूरे अंग इमेजिंग की तुलना में, यह जांच करने के लिए जहां प्रत्येक प्रक्रिया जब fluorescently लेबल यौगिकों की जैव-वितरण की जांच का उपयोग करने के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक है सार्थक हो जाता है। इस प्रोटोकॉल, कैसे इन तरीकों को एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता कुशलता rhodamine- लेबल Elastin तरह पॉलीपेप्टाइड (ELP) के जैव वितरण तुलना करने के लिए, के साथ या SynB1 या गूंथना सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के अलावा बिना का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है के माध्यम से intranasal (में) और नसों (चतुर्थ) प्रशासन मार्गों।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि पूर्व vivo पूरे अंग इमेजिंग आम तौर पर सीधा है, कुछ बुनियादी अवधारणाओं और तकनीकों के पालन जैव वितरण माप की सटीकता में सुधार कर सकते हैं। प्रकाश अनुभव के लघु तरंग दैर्ध्य सबसे ऊतकों में बिखरने और absorba…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
Riferimenti
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