L'impiego di<em> Ex Vivo</em> Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente
Summary
Ex vivo di imaging intero organo è un metodo rapido per determinare le concentrazioni relative dei composti fluorescente all'interno e tra tessuti o gruppi di trattamento. Al contrario, la fluorescenza istologia quantitativa, mentre più alta intensità di lavoro, consente la quantificazione dei livelli tissutali assoluti di molecole marcate.
Abstract
Etichettatura fluorescente è un processo ben consolidato per esaminare il destino di molecole marcate sotto una varietà di condizioni sperimentali sia in vitro che in vivo. sonde fluorescenti sono particolarmente utile per determinare la bio-distribuzione di grandi molecole somministrate, in cui è improbabile che possa influenzare la cinetica o biodistribuzione del composto l'aggiunta di una etichetta fluorescente piccola molecola. Una varietà di metodi esistenti per esaminare la biodistribuzione che variano in modo significativo la quantità di sforzo richiesto e se le misurazioni risultanti sono pienamente quantitativa, ma utilizzando diversi metodi in combinazione può fornire un sistema rapido ed efficace per analizzare bio-distribuzioni.
Ex vivo di imaging intero organo è un metodo che può essere utilizzato per confrontare rapidamente le concentrazioni relative di molecole fluorescenti all'interno dei tessuti e tra i diversi tipi di tessuti o gruppi di trattamento. L'utilizzo di un plat di imagingmodulo progettato per live-animale o di imaging intero organo, fluorescenza all'interno dei tessuti intatti può essere determinata come tali, risparmiando tempo e lavoro, fornendo un quadro preciso della bio-distribuzione complessiva. Questo processo è ideale in esperimenti tentano di determinare la specificità tissutale di un composto o per il confronto delle molteplici composti diversi. Quantitative istologia tessuto invece richiede una ulteriore elaborazione dei tessuti al fine di creare una misura quantitativa dei composti marcati. Per valutare in modo accurato bio-distribuzione, tutti i tessuti di interesse devono essere tagliati, la scansione, e analizzati relativi alle curve standard per fare confronti tra tessuti o gruppi. Quantitative istologico del tessuto è il gold standard per determinare le concentrazioni di composti assolute all'interno dei tessuti.
Qui, descriviamo come entrambi i metodi possono essere utilizzati insieme in modo efficace per valutare la capacità dei diversi metodi di gestione aND modifiche composti di indirizzare e fornire molecole fluorescente al sistema nervoso centrale 1.
Introduction
etichettatura fluorescente è un metodo semplice ed efficace utilizzato per determinare la biodistribuzione di composti, utilizzando una serie di apparecchiature che è comune a molti laboratori. Fluorofori sono ampiamente disponibili, relativamente poco costoso, e sono disponibili in una varietà di lunghezze d'onda, in modo tale che più etichettato molecole possono essere utilizzati contemporaneamente senza interferenze. La maggior parte dei fluorofori hanno una gamma di chimiche per coniugazione a diversi gruppi reattivi sui composti bersaglio, e il processo di coniugazione è generalmente semplice per la maggior parte dei siti reattivi. Inoltre, le attrezzature necessarie per le misure di composti fluorescente sono comuni in molti laboratori. microscopi a fluorescenza, imager e scanner di diapositive possono essere utilizzati in diverse circostanze, rendendo l'uso di marcatura fluorescente altamente accessibile. Etichette fluorescenti vengono spesso utilizzati per determinare la biodistribuzione e cinetica di composti sia in vivo ed ex vivO con dispositivi di imaging in tempo reale, come la Spectrum IVIS Imager, e di istologia del tessuto quantitativa 2,3.
L'utilizzo di ex vivo di imaging intero organo utilizzando dispositivi di imaging dal vivo è aumentata nel corso del tempo a causa della loro facilità d'uso e la capacità di creare rapidamente un confronto accurato delle relative concentrazioni di composti etichettati senza richiedere l'ulteriore trattamento dei tissues4. Tuttavia, mentre ex vivo di imaging intero organo può consentire una facile analisi e confronto, non genera una misura quantitativa della concentrazione di composti assolute all'interno di un tessuto. Ciò è dovuto ad effetti di dispersione della luce all'interno organi intatti. Dal momento che la dispersione della luce (e, in misura minore, assorbanza) varia in base alle dimensioni del tessuto e la densità, l'imaging intero organo può sottovalutare livelli tissutali di organi di grandi dimensioni o densi. La formulazione di standard adeguati per misure della concentrazione assolute è anche difficile perché si deve imitare lo spessoree la densità di ogni singolo organo. D'altra parte, imaging intero organo è un metodo rapido per ottenere i livelli tissutali relativi di un agente, ed è ideale per confrontare la relativa biodistribuzione del correlata più molecole (ad esempio in studi di droga targeting). Una strategia alternativa è quella di utilizzare istologia fluorescenza quantitativa, una tecnica derivata dal metodo di autoradiografia quantitativa, per ottenere livelli tissutali assoluti di un agente di test 5,6. Piuttosto che inserire un intero animale o di un organo in un dispositivo di immaginazione, l'istologia del tessuto quantitativa richiede che ogni tessuto essere affettato, montate su slitte, digitalizzati e analizzati singolarmente. Standards dell'agente di prova sono preparati e tagliati allo stesso spessore dei campioni di organi. Tagliando tutti gli organi e standard per lo stesso spessore, variabilità dovuta alla dispersione della luce o l'assorbanza viene eliminato, e l'intensità di fluorescenza del tessuto può essere in forma alla curva standard per determinare concent assolutarazione. Anche se questo metodo, se fatto correttamente, è quantitativa, è anche ad alta intensità di manodopera e facilmente maltrattato. Data la natura più complessa di istologia quantitativa e significativamente maggiore costo del lavoro rispetto all'imaging intero organo, diventa utile esaminare dove ogni processo è più pratico da utilizzare quando esame della biodistribuzione di composti fluorescente. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come questi metodi possono essere utilizzati insieme per confrontare efficacemente la biodistribuzione di rodamina marcato elastina come polipeptide (PEL), con o senza aggiunta di peptidi cellule penetrante SynB1 o Tat, tramite intranasale (IN) e (iv) vie di somministrazione per via endovenosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre ex vivo di imaging intero organo è generalmente semplice, l'adesione ad alcuni concetti e tecniche di base può migliorare la precisione delle misure di bio-distribuzione. lunghezze d'onda corte di esperienza luce un alto grado di dispersione e di assorbanza nella maggior parte dei tessuti, che in modo significativo l'impatto l'utilità del fluorofori a breve lunghezza d'onda. Questi fluorofori hanno limitato l'applicazione negli studi profondo dei tessuti, ma sono stati utilizza…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
Riferimenti
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