Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Røntgenkrystallografi har været og vil fortsat være, en ekstremt kraftfuld teknik til at forstå naturen af ligand-receptor-interaktioner. Ved at visualisere disse interaktioner i atomare detaljer, ikke alene er det muligt at videregive de molekylære mekanismer, der styrer mange biologiske processer, men det er også muligt direkte at ændre kontaktflader til terapeutisk gavn. Kombineret med teknikker såsom overfladeplasmonresonans og isotermiske titrering kalorimetri (for blot at nævne et par), kan sådanne ændringer derefter analyseres biofysisk at vurdere den direkte indvirkning på bindende affinitet, interaktion kinetik, og termodynamik. Endelig ved at udføre funktionelle eksperimenter på relevante celletyper, et detaljeret billede af den molekylære og funktionelle konsekvenser af ændringer receptor-ligand interaktioner kan udledes, giver meget specifik mekanistisk information. Samlet set har disse typer af metoder giver en atomar opløsning billede muliggør afskrække melse af, hvordan biologiske systemer fungerer, med deraf følgende konsekvenser for diagnostiske og terapeutiske fremskridt.
Vores laboratorieformål rutinemæssigt disse teknikker til at studere de receptorer, der medierer human T-celle-immunitet over for patogener og cancer, autoimmunitet, og under transplantation. Her har vi fokus på den humane CD8 + T-celle-respons på kræft, medieret af en interaktion mellem T-cellereceptor (TCR) og human leukocyt antigen (HLA) -begrænset tumorafledte peptider (pHLA). Dette er vigtigt, fordi, selvom CD8 + -T-celler er i stand til at målrette cancerceller, har vi og andre tidligere vist, at anti-cancer TCR'er suboptimalt binde til deres beslægtede pHLA 1, 2. Således har mange laboratorier forsøgt at ændre hverken TCR 3, 4, 5 eller peptidliganden 6,class = "xref"> 7, 8 for at øge immunogenicitet og til bedre at målrette cancerceller. Men disse metoder er ikke altid effektive, og kan have alvorlige bivirkninger, herunder off-target toksiciteter 4, 9, 10. Yderligere forskning udforske de molekylære mekanismer, der styrer T-celle genkendelse af cancer-antigener vil være afgørende for at overvinde disse mangler.
I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på de responser mod autologe melanomceller efter CD8 + -T-celler specifikke for et fragment af differentiering melanocyt antigen glycoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, præsenteret af HLA-A * 0201 (det mest almindeligt -expressed human pHLA klasse I). Dette antigen har været et almindeligt studerede mål for melanom immunterapi og er blevet udviklet som en såkaldt "heteroclitisk" peptid, hvori en valin erstatter alaninanker position 9 for at forbedre pHLA stabilitet 11. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at øge induktionen af melanom-reaktive CTL'er in vitro og er med succes blevet anvendt i kliniske forsøg 12. Ændringer af peptid-rester, kan dog have uforudsigelige effekter på T-celle specificitet, fremgår af den dårlige effekt af de fleste heterolitic peptider i klinikken 6, 13. Faktisk anden heteroclitisk form for gp100 280-288, hvori peptidrest Glu3 blev erstattet af Ala, ophævet genkendelse af en polyklonal population af gp100 280-288 -specifikke T-celler 14, 15. Vi har tidligere vist, at selv mindre ændringer i peptid anker rester væsentligt kan ændre T-celle genkendelse på uforudsigelige måder 6, 16. Således Undersøgelsen fokuserede på building et mere detaljeret billede af, hvordan CD8 + T-celler genkender gp100 og hvordan ændringer af samspillet mellem TCR og pHLA kan påvirke denne funktion.
Her, genereret vi stærkt rene, opløselige former af to TCR'er specifikke for gp100 280-288 præsenteret af HLA-A * 0201 (A2-YLE) samt de naturlige og ændrede former af pHLA. Disse reagenser blev anvendt til at generere proteinkrystaller at løse den ternære atomare struktur af en human TCR i kompleks med det heteroclitisk form af A2-YLE, samt to af de mutante pHLAs i uligeret formular. Vi brugte derefter et peptid scanning tilgang til at demonstrere effekten af peptid udskiftninger på TCR ved at udføre dybdegående biofysiske eksperimenter. Endelig har vi skabt en genetisk modificeret CD8 + T-cellelinje, omprogrammeret til at udtrykke et af A2-YLE-specifikke TCR'er, for at udføre funktionelle eksperimenter for at teste den biologiske virkning af de forskellige peptidmodifikationer. Disse data viser, at selv Modifikationer til peptid rester, der er uden for TCR bindende motiv kan have uforudsigelige afsmittende virkninger på tilgrænsende peptid rester, der ophæver TCR binding og T-celle genkendelse. Vores resultater repræsenterer det første eksempel på de strukturelle mekanismer bag T-celle genkendelse af dette vigtige terapeutiske mål for melanom.
Protokollerne er skitseret her, udgør en ramme for den molekylære og cellulære dissektion af T-celle responser i forbindelse med en hvilken som helst sygdom hos mennesker. Selvom kræft var det vigtigste fokus i denne undersøgelse, har vi brugt meget lignende metoder til at undersøge T-celle responser på virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 og under autoimmunitet 38, 39, 40. Endvidere har vi anvendt disse teknikker mere bredt at forstå de molekylære principper, der styrer T-celle-antigen-genkendelse 2, 19, 41, 42. Faktisk den uforudsigelige ændringer peptid rester, selv demuden for de TCR kontakt rester, påvirkninger T-celle genkendelse har vigtige implikationer for udformningen af heteroclitisk peptider. Disse resultater er direkte bidraget til udviklingen af hidtil ukendte T-celleterapi, herunder peptidvacciner 6, 43 og kunstige høj affinitet TCR'er 3, 4, 5, 20, 44, samt af forbedrede diagnostik 45, 46, 47.
Kritiske trin i protokollen
Genereringen af et særdeles rent, funktionelt protein er essentiel for alle de metoder, der er skitseret i dette dokument.
Ændringer og fejlfinding
Vanskeligheder med at generere meget rent protein vedrører ofte udtryk for stærkt-pure, uopløselig IB'er fra E. coli-ekspressionssystem. Normalt modificering udtrykket protokol (f.eks, overtalelse ved forskellige optiske tætheder, ved hjælp af forskellige E. coli stammer, eller ved hjælp af forskellige medier formationer) løser disse problemer.
Begrænsninger af teknikken
Disse teknikker anvender opløselige proteinmolekyler (TCR og pHLA), der normalt udtrykkes på celleoverfladen. Således er det vigtigt at sikre, at de strukturelle / biofysiske fund er i overensstemmelse med cellulære tilgange at bekræfte biologisk betydning.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Gennem brug af røntgenkrystallografi og biofysik underbyggede gennem funktionel analyse, har vi og andre viste, at TCR'er specifikt for cancer-epitoper er generelt karakteriseret ved lave bindingsaffiniteter 48. Denne lave TCR affinitet kan hjælpe med at forklare, hvorfor T-celler are ikke naturligt effektiv på clearing kræft. Høj opløsning atomare strukturer af komplekser mellem anti-cancer TCR'er og beslægtede tumorantigener er begyndt at afsløre den molekylære basis for dette svage affinitet. Desuden er disse undersøgelser er nyttige til at bestemme de mekanismer, der ligger til grund for terapeutiske tiltag, der skal løse dette problem, såning fremtidige forbedringer 16. I denne undersøgelse undersøgte vi den første struktur af en naturligt forekommende αβTCR i kompleks med et gp100 HLA-A * 0201-begrænset melanom epitop. Strukturen, kombineret med en grundig biofysisk undersøgelse afslørede overordnet bindende form for interaktion. Vi afdækkede også en uventet molekylær omskifter, der opstod i en muteret form af peptidet, der ophævede TCR binding (vurderet ved anvendelse af overfladeplasmonresonans) og CD8 + T-celle-genkendelse (funktionelle eksperimenter). Det var kun muligt at påvise denne nye mekanisme af HLA-antigen presentatiom brug af høj opløsning beskrevne fremgangsmåder.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik
Samlet set vores resultater viser magt røntgenkrystallografi og biofysiske metoder, når det kombineres med robuste funktionelle analyser. Ved hjælp af disse metoder, er det muligt at dissekere præcise molekylære mekanismer, der styrer T-celle antigen-genkendelse. Det er faktisk også muligt at anvende denne fremgangsmåde til at løse strukturen af ikke-ligeret TCR'er, der viser, hvordan konformationelle ændringer kan spille en rolle under antigen diskrimination 49, 50, 51. En bedre forståelse af den meget komplekse og dynamiske natur som understøtter TCR-pHLA interaktioner har også åbenlyse konsekvenser for terapi design. Direkte kan "se" de molekyler, der bliver terapeutisk målrettet, samt den virkning, at modifikationer har på antigen recognition, vil helt klart forbedre udviklingen af disse lægemidler fremover. I denne undersøgelse viser vi, at selv ændringer i et enkelt peptid rest, som ikke kraftigt indgreb med en TCR uforudsigeligt kan overføre strukturelle ændringer af andre rester i HLA-peptid, som igen, dramatisk ændrer T-celle genkendelse. En mere fuldstændig forståelse af de molekylære mekanismer der anvendes i løbet T-celle antigen-genkendelse vil være enormt gavnligt, når udformningen af fremtidige terapier for en lang række humane sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
BM er støttet af en Cancer Research UK Ph.d. studentship. AG er støttet af en Life Science Research Network Wales Ph.d. studentship. VB er støttet af en Cancer Research Wales Ph.d. studentship. DKC er en Wellcome Trust Research Career Development Fellow (WT095767). AKS er en Wellcome Trust Investigator. GHM er finansieret af en fælles Life Science Research Network Wales og Tenovus Cancer Care Ph.d. Studentship. Vi takker personalet på Diamond Light Source for at stille faciliteter og support.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |